叉頭盒蛋白M1和基質(zhì)金屬蛋白酶-2在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及意義

張新宇 王紹清

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

叉頭盒蛋白M1(FoxM1)是 Fox亞家族成員之一，是一種與增殖相關(guān)的特異性轉(zhuǎn)錄因子。已有研究〔1～3〕表明， FoxM1的高表達(dá)與腫瘤的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。明膠酶A是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)家族重要成員之一，具有降解細(xì)胞外Ⅳ膠原成分、促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移的作用〔4,5〕。本研究主要應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中FoxM1和MMP-2的表達(dá)情況，探討它們與NSCLC臨床分期、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系，為NSCLC預(yù)后的評估及治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1對象 選取2005年4月至2007年1月在本院就診經(jīng)外科手術(shù)切除并存檔的NSCLC石蠟標(biāo)本60例。所有患者術(shù)前均未接受任何放化療。其中男41例，女19例，年齡47～78歲，中位年齡62歲； 鱗癌38例，腺癌19例，腺鱗癌2例，大細(xì)胞癌1例。采用美國MD Anderson醫(yī)學(xué)中心和國立癌癥研究所肺癌研究組(UICC)制訂的第6版肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期〔6〕：T1期26例，T2 期28例，T3期5例，T4期1例；N0期44例，N1期14例，N2期2例；M期0例。臨床TNM分期：Ⅰ期40例，Ⅱ期15例，Ⅲ～Ⅳ期5例。兔抗人FoxM1多克隆抗體購于Santa Cruz 公司(美國，SC-502)，兔抗人MMP2多克隆抗體購于Santa Cruz 公司(美國，SC-10736)。SP免疫組化檢測試劑盒(中國，SP9100)和DAB(中國，ZLI-9017)顯色液均購自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.2實驗方法 取石蠟包埋組織4 μm厚度連續(xù)切片，石蠟切片常規(guī)脫蠟、脫水、置入抗原修復(fù)液(枸櫞酸)中修復(fù)5 min。采用SP法免疫組化染色，兔抗人FoxM1多克隆(1∶200)，兔抗人MMP-2多克隆抗體(1∶200)，具體操作按說明書進(jìn)行。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色、蘇木素復(fù)染。堿性磷酸鹽(PBS)緩沖液代替一抗作陰性對照。

1.3判斷標(biāo)準(zhǔn) 高倍鏡下隨機(jī)選取5個視野觀察200個細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜內(nèi)呈現(xiàn)清晰棕黃色顆粒染色的為陽性細(xì)胞。對所觀察視野細(xì)胞進(jìn)行染色強(qiáng)度和染色范圍綜合評分〔7〕。細(xì)胞染色強(qiáng)度評分：0分(陰性，無染色)，1分(弱陽性，淺黃色顆粒)，2分(陽性，棕黃色顆粒)，3分(強(qiáng)陽性，深褐色顆粒)。細(xì)胞染色范圍評分：0分(0%)，1分(1%～25%)，2分(26%～50%)，3分(51%～75%)，4分(76%～100%)。每張切片染色強(qiáng)度和染色范圍的和作為最后的染色評分(0～7分)，≥4分認(rèn)為該切片染色結(jié)果為陽性。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行分析，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性分析應(yīng)用Spearman等級相關(guān)分析法。

2 結(jié) 果

2.1FoxM1及MMP-2在NSCLC組織中級癌旁正常肺組織中的表達(dá) FoxM1蛋白陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，少量表達(dá)于細(xì)胞核。NSCLC組織中FoxM1蛋白陽性表達(dá)率為 43.3%(26/60)(圖1)，癌旁肺組織中為9.1%(1/11)，NSCLC組織中FoxM1的表達(dá)率明顯高于正常組織(χ2=4.625，P<0.05)。MMP-2蛋白陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)。NSCLC組織中MMP-2蛋白陽性表達(dá)率為68.3%(41/60)(圖1)，癌旁肺組織中為0%(0/11)，NSCLC組織中MMP-2的表達(dá)率明顯高于正常組織(χ2=17.789，P<0.05)。

2.2FoxM1及MMP-2表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系 FoxM1的表達(dá)與患者性別、腫瘤的組織學(xué)類型無關(guān)(P>0.05),而與腫瘤的分化程度、腫瘤大小、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床TNM分期及患者是否吸煙有關(guān)(P=0.007，0.009，0.003,0.002,0.043)。MMP-2的表達(dá)與患者性別、組織學(xué)分型、T分期、臨床TNM分期及患者是否吸煙無關(guān)(P>0.05),而與腫瘤的分化程度、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.011，0.034)有關(guān)。見表1。

2.3FoxM1及MMP-2蛋白表達(dá)的相關(guān)性 在NSCLC組織中FoxM1和MMP-2同時表達(dá)陽性的有22例，同時表達(dá)陰性的有15例，F(xiàn)oxM1表達(dá)陽性而MMP-2表達(dá)陰性的有4例，F(xiàn)oxM1表達(dá)陰性而MMP-2表達(dá)陽性的有19例。Spearman等級相關(guān)分析結(jié)果顯示，兩者在NSCLC中表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.306，P=0.010)。

表1 FoxM1及MMP-2蛋白表達(dá)與NSCLC臨床病理參數(shù)的關(guān)系〔n(%),n=60〕

3 討 論

肺癌是最常見的呼吸系統(tǒng)腫瘤，發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。盡管現(xiàn)在治療手段的不斷提高，但是NSCLC患者5年生存率仍然較低〔8〕，在分子水平尋找肺癌可能的治療靶點(diǎn)備受關(guān)注。 FoxM1為Fox基因家族成員之一，該家族成員機(jī)構(gòu)的共同特征由110個氨基酸組成的進(jìn)化保守的同源DNA結(jié)合區(qū)(DBD)，稱為“叉頭框”。FoxM1在維持細(xì)胞凋亡與增殖之間的動態(tài)平衡重發(fā)揮重要的作用，是一種增殖相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子〔1〕。目前研究表明，F(xiàn)oxM1在多種惡性腫瘤中均存在高表達(dá)〔1～3〕，并且其高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

鑒于FoxM1具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長的作用〔9〕，一些研究已經(jīng)對FoxM1是否能作為一種預(yù)測NSCLC患者的臨床預(yù)后指標(biāo)進(jìn)行了研究。其中包括： 在肺鱗癌中，F(xiàn)oxM1的表達(dá)與肺癌分化及患者預(yù)后關(guān)系密切〔10〕；FoxM1可以作為預(yù)測肺、鱗癌和腺癌患者預(yù)后的一個獨(dú)立因素，但FoxM1的表達(dá)和臨床病理學(xué)特征之間沒有任何關(guān)系〔11〕。 這些結(jié)果的不同可能是由于不同研究對象、不同樣本量和不同診斷標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)。本研究結(jié)果提示FoxM1的表達(dá)與NSCLC的發(fā)生密切相關(guān)，與其他學(xué)者〔10〕的研究結(jié)果相似。Gialmanidis等〔12,13〕研究認(rèn)為 FoxM1的表達(dá)與NSCLC分化、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)與NSCLC的組織學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。而本組研究結(jié)果顯示FoxM1的表達(dá)參與NSCLC的發(fā)展過程，可能是影響患者預(yù)后的重要因素之一。

因為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期都是影響患者預(yù)后的主要因素，提示FoxM1與NSCLC的進(jìn)展有密切關(guān)。有學(xué)者〔14〕下調(diào)FoxM1表達(dá)后，NSCLC細(xì)胞體外遷移和侵襲能力下降，并且下調(diào)肺癌細(xì)胞中FoxM1的表達(dá)的同時MMP-2表達(dá)水平也下調(diào)，說明FoxM1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲的作用與調(diào)控MMP-2表達(dá)有關(guān)。腫瘤的轉(zhuǎn)移涉及一系列復(fù)雜的步驟,包括腫瘤細(xì)胞間的附著力下降、細(xì)胞的附著、基質(zhì)的溶解和遷移合成及分泌大量基質(zhì)降解酶 是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要步驟〔15〕。其他一些研究表明，MMP已成為在瘤局部生長和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的中心因素〔15,16〕。本研究結(jié)果提示MMP-2 的過表達(dá)與NSCLC 預(yù)后不良密切相關(guān)，并表明FoxM1可能通過調(diào)控MMP-2表達(dá)參與肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的過程。

綜上，本文FoxM1參與NSCLC組織中的發(fā)生、發(fā)展過程。FoxM1促進(jìn)肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移過程與激活MMP-2信號有關(guān)。FoxM1可能成為腫瘤治療的一個靶點(diǎn)，本研究為以FoxM1為靶點(diǎn)的治療提供了實驗依據(jù)，但是其在不同類型肺癌中的作用尚需進(jìn)一步研究。

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