甘肅甘南野生羊肚菌rDNA的ITS序列分析

王 龍，秦 鵬，王生榮，趙玉卉

(1.甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅省科學院 生物研究所， 甘肅 蘭州 730000)

羊肚菌Morchellavspp.隸屬于子囊菌亞門Ascomycotina、盤菌綱Discomycetes、盤菌目Pezizales、羊肚菌科Morchellaceae，是世界公認的一類珍稀食(藥)用真菌。現有資料表明，各種羊肚菌相互間的宏觀特征有著明顯的差距，目前，不同學者對羊肚菌種的劃分從3個種到32個種不等[1]。在我國西南各省、華東地區以及西北省份均已見到有關羊肚菌的種類分布、生態環境、資源調查與研究利用等方面的詳實報道[2-6]。甘肅省甘南藏族自治區位于甘、青、川的過渡地帶，地理位置N 33°20′～35°40′，E 100°52′～104°45′，海拔3 000～4 000 m，地勢高崇，屬高寒氣候區[7]。該地區植被覆蓋率高，生物群落穩定，其獨特的氣候特點造就了豐富的生物資源，也為羊肚菌的發生提供了優越的多樣性生態條件。應用rDNA的ITS序列分析方法對在甘南地區采集、收集到的野生羊肚菌進行了分類鑒定，為深入研究該地區羊肚菌種類分化的變異規律提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

2011～2013年，以甘肅省甘南境內的森林山地、高原濕地和高寒草甸3種不同生態類型為重點進行當地野生羊肚菌真菌資源的采集與收集工作，先后共采集62株形態完好的野生羊肚菌子實體標本。參照卯曉嵐主編《中國蕈菌》(2009年第1版)，根據收集到的羊肚菌子囊果的形狀、顏色、大小及脈絡特征等，同時參照網絡數據庫“Index Fungorum”中羅列的世界范圍內羊肚菌的名稱(包括種、亞種、變種及變型)，初步將其分類編號GN-M1、GN-M2、GN-M3、GN-M4、GN-M5、GN-M6和GN-M7。7個供試菌株子實體形態特征見圖1。

1.2 基因組DNA的提取和ITS序列的擴增

取羊肚菌子實體的菌蓋部分，用新型植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN)提取樣品基因組DNA，并保存于4 ℃冰箱。采用White設計的ITS擴增通用引物ITS1和ITS4對供試材料的rDNA-ITS序列進行PCR擴增[8]。

ITS引物：上游引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGA ACCTGCGG-3′

下游引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3′

(引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成)。

圖1供試羊肚菌子實體形態

Fig.1ThemorphologyofMorchellaspp.

PCR擴增反應體系為50μL，含:10×PCR buffer 5.0 μL；dNTPs 1.0 μL；模板DNA 1.0 μL；ITS1 1.0 μL；ITS2 1.0 μL；Taq聚合酶1.0 μL；雙蒸水40.0 μL[9]。

PCR擴增程序：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性40 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸100 s，35個循環；72 ℃補平10 min，終止溫度為4 ℃。采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測ITS-PCR擴增產物，用凝膠成像系統拍照記錄電泳譜帶。

1.3 ITS擴增產物的序列分析和系統樹的構建

PCR擴增產物經電泳檢測后，使用上海生工生物工程技術服務有限公司提供的UNIQ-10柱式 DNA膠回收試劑盒進行回收和純化，并將樣品送至上海生工進行測序。用DNAman對序列進行拼接，并對兩端進行修剪。將序列在GenBank上進行BLAST分析，利用ClustalX 1.81進行同源性比較，MEGA 6.0繪制分子系統樹[10]。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果及BLAST比對分析

PCR擴增出的目的片段條帶單一清晰(圖2)，GN-M1，GN-M2，GN-M3，GN-M4，GN-M5大小在1 000 bp～2 000 bp。序列經DNAman拼接后，大小均為1 200 bp，GN-M6和GN-M7的ITS序列在760 bp。將各供試樣品的ITS序列提交GenBank數據庫進行BLAST序列比對分析，結果顯示，GN-M1、GN-M2、GN-M3與粗柄羊肚菌(GQ228465、AJ623265、GQ228446)序列的相似度達98%～99%；GN-M4、GN-M5與羊肚菌 (AM397272)序列的相似度達95%；GN-M6與黑脈羊肚菌(AJ544203)序列的相似度達99%；GN-M7與高羊肚菌(EF017946)序列的相似度達98%，且GN-M1、GN-M2、GN-M3和GN-M4、GN-M5的G+C含量>55%，GN-M6和GN-M7的G+C含量<55%(表1)。即BLAST比對的結果表明，7個供試羊肚菌子實體代表羊肚菌屬中的4個種，分別為粗柄羊肚菌M.crassipes、羊肚菌M.esculenta、黑脈羊肚菌M.angusticeps和高羊肚菌M.elata。

圖2 PCR擴增的ITS片段電泳檢測圖

注：圖中1 GN-M1，2 GN-M2，3 GN-M3，4 GN-M4，5 GN-M5，6 GN-M6，7 GN-M7

2.2 基于ITS序列的系統樹

把7個樣品的ITS序列與GenBank中的尖頂羊肚菌M.conica(AM269501)、小海綿羊肚菌M.spongiola(DQ228476)、半開羊肚菌M.semilibera(AF008233)、高羊肚菌M.elata(EF017946)和紅褐羊肚菌M.rufobrunnea(DQ355921)的 ITS序列進行比對，并用MP法構建分子系統樹。從分子系統樹可以看出(圖3)，GN-M1、GN-M2、GN-M3和GN-M4和GN-M5與小海綿羊肚菌M.spongiola聚為第1類群，屬于形態學分類中的黃羊肚菌類群(yellow morel)；GN-M6、GN-M7與高羊肚菌M.elata和尖頂羊肚菌M.conica聚為第2類群，屬于形態學分類中的黑羊肚菌類群(black morel)，紅褐羊肚菌和半開羊肚菌各自單獨聚為一類。聚類結果表明，試驗樣品與這幾種羊肚菌有一定的遺傳距離，但樣品彼此之間的遺傳關系很近，粗柄羊肚菌和羊肚菌屬于黃羊肚菌類群(yellow morel)，而黑脈羊肚菌和高羊肚菌屬于黑羊肚菌類群(black morel)。

表1 羊肚菌ITS測序結果

圖3 基于ITS序列的分子系統樹(MP法，Bootstrap驗證，重復1 000次)

3 討論

rDNA的ITS區同時具有多變區和保守區，5.8S、18S和28S的序列在進化中趨于保守，種間變化小，而內轉錄間隔區ITS1和ITS2作為非編碼區，最終不加入成熟核糖體，所以受到的選擇壓力較小，進化速度快，種間差異大，且變異速度存在著較大的差異，適合種及種以下水平的分類研究[11]。以ITS區作為信號分子對甘肅甘南藏族自治州境內的野生羊肚菌進行了分子鑒定，發現7株供試羊肚菌菌株代表4個種，分別為粗柄羊肚菌、羊肚菌、黑脈羊肚菌和高羊肚菌，并歸為黃羊肚菌類群(yellow morel)和黑羊肚菌類群(black morel)兩大類。從分子系統樹看來，供試羊肚菌之間ITS序列變異較大，可能是因為生長地的氣候、海拔、植被等環境因素的不同導致羊肚菌的子實體有形態上的差別，對羊肚菌的系統進化產生了不同的影響，此種種內差異還有待收集更多的資料進一步研究。

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