流式細胞術在細菌快速檢測中的應用研究

董成霞

山東省濟南市濟陽縣人民醫院，山東濟南 251400

流式細胞術于90年代末期被創建，最初僅用于臨床檢驗和科學研究，由于微生物的粒子或細胞較小，因此在微生物領域應用的較晚。但在近幾年來，隨著熒光染料的改良和豐富、光學科技的不斷完善，以及流式細胞檢測儀自身的不斷發展進步。在如今，流式細胞術在微生物領域得到較為廣泛的應用，尤其是對于細菌學問題的解決具有多參數測量精確，并且迅速的特點。

1 流式細胞術在環境樣品細菌檢測中的應用

以往對環境樣品通常應用的方法為平板法，對微生物的多樣性和總菌數的深入研究具有嚴重的制約性，常會給檢測結果帶來較大的誤差，并且其他傳統的檢測方法，具有操作復雜繁瑣的特點。但流式細胞是在環境樣品中的推廣應用，具有測定精準、制備簡單、可快速的對多參數數據進行采集，以及可對多元數據進行分析。如今，流式細胞術已廣泛的應用于土壤、水和空氣等環境中的微生物研究的重要工具，圖1為流式細胞術的樣品制備技術。

圖1 流式細胞術的樣品制備技術

曾有學者應用熒光原位雜交技術結合流式細胞檢測儀對豬谷倉空氣和實驗室空氣中的微生物進行測定。先用液化收集器獲取樣品，然后用熒光染料染色后，應用流式細胞術辨別樣品粉塵雜質中的菌體，并且可通過計數處理，獲取細菌總數。流式細胞術還可用以土壤樣品的檢測，Jean Christophe等學者應用流式細胞術對土壤樣品中的微生物進行定量和定性檢測。應用溴化乙錠和跟16SrRNA具有互補作用的熒光探針結合光散射參數對菌體的大小進行限定，然后從土壤微生物的粉塵碎片和群落中區分出絮凝劑產生菌檢測菌[1]。

另外，還有學者應用該術對水環境進行細胞的快速檢測,采用流式細胞術和FISH對新加坡壓艙水的腸道菌數、弧菌數、細菌總數和大腸桿菌屬進行檢測。經檢測結果發現，應用不同取樣點的壓艙水，其檢測結果會存在較大的差異，該種現象說明航運業的壓艙水的水質情況較為復雜，并且受到多種因素的制約和影響。這些檢測實驗表明，應用流式細胞術能夠進行水質檢測和污染監測，在工業不斷發展的今天，對于生態文明建設，該監測方法的應用具有極為重大的意義。

2 流式細胞術在臨床細菌檢測中的應用

流式細胞術在最初主要應用為哺乳類動物的檢測，在臨床上的應用極為少見。但目前在臨床中，已得到廣泛的應用，并且樣品的檢測范圍也從最初的的真核細胞檢測擴展到原核生物的細胞檢測中，甚至可對更小的病毒進行檢測。具有快速、靈敏的特點，對促進病癥的及時確診具有重要的作用。較為常用，并且效果最佳的是對于菌血癥的診斷。在臨床檢查中，異質性和藥敏性極為常見，并且兩者間具有緊密的聯系，流式細胞術在臨床細菌檢測中的應用，最初始于對藥敏性的檢測。

Su11er曾應用流式細胞術檢測氨芐青霉素、萬古霉素和頭孢他啶，分別對其金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌的藥敏性反應進行檢測。其結果表明，應用流式細胞術能夠靈敏、快速的對抗生素的抗菌效應進行檢測，同時應用細胞氧化活性燃料CTC，可檢測出多個不同的細胞亞群，由于不同的細菌亞群對于抗生素敏感性并不相同，因此能夠較為直觀的反映細胞的異質性[2]。付亮等學者應用臨床分離出的肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌，結合流式細胞術和確證實驗兩種方法進行兩種藥物敏感性的檢測。其檢測結果表明，流式細胞術和傳統的檢測結果具有一致性的特征，但更富有客觀、自動化和快速的特性，能夠聯合應用于藥敏性的實驗研究。流式細胞技術還可獲取異質性和藥敏性的相關信息，屬于有效的檢測手段。該技術在臨床疾病診斷中的優勢，在于其檢測結果能夠幫助對疾病進行及時的診斷，特別是對于急性病的診斷，具有較大的應用價值。

流式細胞術在臨床醫學中的應用，還可應用于其他病菌的檢測。有學者曾應用結合分支桿菌采用熒光素SYBRGreen I和二氧化硅納米顆粒兩種燃料標記后，結合流式細胞術進行檢測。其檢測的菌濃度可低至3.5×103～3.0×104個/mL，相對于單純使用FITC染色的流式細胞術應用更為明顯[3]。此外，據有關實驗表明，流式細胞術的臨床細菌診斷，并不僅僅是局限于普通的細菌檢測，還可用于休眠體的檢測，能夠在其活化前，對疾病作出診斷，進行盡早的診斷，對于患者的康復具有重要作用。

3 流式細胞術在趨磁細菌研究中的應用前景

趨磁細菌于1975年由美國科學家B1akemore首次發現，因為其體內據有較小的次磁小體，受到諸多科學家的關注。在目前，對于趨磁細菌磁小體的合成機理并沒有明確的文獻指出，在研究中，依然存在較多的問題。其中的關鍵性問題在于對磁小體合成量的檢測，也即磁性的表征，對于優化磁小體的合成培養條件形成了限制，制約磁小體的大量合成[4]。在近幾年來，有學者曾應用流式細胞儀對趨磁細菌進行檢測應用，但文獻較少，并且缺乏深層次的研究。

結合流式細胞儀的應用原理，以及檢測微粒時可應用熒光染料標記定量測量的特點，初步推斷流式細胞術能夠應用于檢測趨磁細菌磁小體合成量。因為趨磁細菌結合體的體內合成磁體較小，并且數量不相等，致使胞內粒度的大小直接受到磁小體多寡的影響。根據流式細胞術側向散射光信息能夠表示細胞胞內粒度的具體情況,因此，流式細胞術在未來的發展研究中，應能夠用于趨磁細菌磁小體量的檢測，但在目前仍未找合適的磁小體熒光探針，所以還有待于進一步的深入研究。此外，流式細胞術還可以應用于趨磁細菌非趨磁標準珠和突變株的檢測研究，據有關研究觀察發現趨磁細菌的非區磁性的突變體能夠自發的形成[5]。但在目前的研究中，流式細胞儀應用于趨磁細菌還存在一定的局限性，需要對其儀器精度的提升深入研究，方能進一步的促進流式細胞術在趨磁細菌中的應用。

4 結語

流式細胞術在微生物領域中的應用較廣，只要可進行熒光分子標記的微粒和細胞，均可應用流式細胞儀檢測。尤其是用以形體較為微小的粒子，具有靈敏度高、迅捷、逐個檢測、多參數分析等優點。但由于其前期的應用成本較高，并且在樣品處理和熒光染料的選擇方面仍然存在一定的局限性，還需進一步的研究。但在現代科技不斷進步發展下，流式細胞術會有更為廣闊的應用前景。

[1]付亮,龍軍,袁小澎.流式細胞術快速檢測產超廣譜β-內酰胺酶細菌的研究[J].廣東醫學,2011,2(4):181-182.

[2]徐黎明,任桂萍,尹杰超,等.基于流式細胞術的scFv抗體庫篩選技術的建立[J].細胞與分子免疫學雜志,2013,3(1):65-68.

[3]何子純,李升錦.流式細胞術檢測胞內重組恥垢分枝桿菌的活力研究[J].中國微生態學雜志,2011,3(8):261-262.

[4]許文芳.CD64、CRP在重癥細菌感染中的診斷價值[J].檢驗醫學,2011,1(2):205-206.

[5]張艷.流式細胞術在微生物檢測中的應用[J].醫療裝備,2011,3(5):203-204.