多種方法提取苧麻組織基因組DNA的質量比較

張平+夏東升+蔡亞君+曾慶福+王軍

摘要:以苧麻[Boehmeria nivea (L.) Gaudich.]的纖維成熟期韌皮組織?種子和根組織為試驗材料,采用CTAB法?SDS法和尿素法提取苧麻基因組DNA?3種DNA提取方法比較,CTAB法提取的DNA質量優于其他兩種方法;3種試驗材料比較,韌皮組織提取的DNA質量最好,其次是種子和根組織?種子提取的DNA濃度最高?設計梯度試驗分析不同研磨時間對韌皮組織和種子總DNA提取質量的影響,結果顯示韌皮組織研磨4 min?種子研磨6 min提取的總DNA質量較好?

關鍵詞:苧麻[Boehmeria nivea (L.) Gaudich.];基因組DNA;提取;組織;CTAB法;SDS法;尿素法

中圖分類號:R281.4;Q7文獻標識碼:A文章編號:0439-8114(2014)11-2682-04

Comparison of the Genomic DNA Extraction Methods From Different Ramie Tissues

ZHANG Ping,XIA Dong-sheng,CAI Ya-jun,ZENG Qing-fu,WANG Jun

(Engineering Research Center for Cleaner Production of Textile Dying and printing Under Ministry of Education,

Wuhan Textile University,Wuhan 430073,China)

Abatract: Extraction of high quality genomic DNA from Ramie tissue is the foundation for the study of molecular biology of ramie. In order to study ramie genome by some molecular test, such as PCR , In this study, CTAB, SDS and urea methods were used to extract the ramie genomic DNA from the phloem tissue of ramie fiber mature phase, seed and root tissue respectively. The DNA extraction effect of three different tissues and methods were compared by ultraviolet spectrophotometry and agarose electroforesis. The results showed that the extraction effect of CTAB method is best than the other two method; the extraction effect of the phloem tissue of ramie fiber mature phase is best in three different tissues, follow by the seed and root tissue. The seed is able to extract high quantity genomic DNA in three extraction methods. In addition we study different milling time of the phloem tissue and seeds to total DNA quality effect by used CTAB and SDS methods. The results showed that the phloem tissue grinding for 4min, seed tissue grinding for 6 minutes can get high quality DNA.

Key words:Boehmeria nivea(L.)Gaudich.;ramie genomic DNA;extraction; tissues; CTAB methods; SDS method; urea method

基金項目:湖北省教育廳優秀中青年科技人才項目(Q20081704);武漢科技學院青年基金項目(20073204);中國紡織工業協會項目(2006074);國家科技支撐計劃項目(2010BA02B00);苧麻生態高值利用技術研究與產品開發項目(2012BAD36B03-04)

苧麻[Boehmeria nivea (L.) Gaudich.]是中國特有的傳統纖維作物,其纖維具有吸濕散熱快?透氣好?不貼身?抗菌?挺括美觀等優點,具有“天然纖維之王”的美譽?現有的中國苧麻品種纖維細度比較粗?剛度大,因此迫切需要選育低結晶度?低取向度?高纖維支數的苧麻新品種,以改善纖維性能[1]?苧麻DNA的提取和純化是其分子研究的基礎?隨著植物分子生物學工作的廣泛開展,建立了各種各樣的基因組DNA提取方法[2]?目前,常用的有十六烷基三乙基溴化銨(CTAB)法[3]?十二烷基磺酸鈉(SDS)法[4]?尿素法[5]等?每種DNA提取和純化方法的原理基本相同,均包括破碎細胞?釋放DNA?去除雜質?分離DNA等一系列步驟?植物組織中含有蛋白質?多糖類化合物及各種次生代謝產物,在提取過程中影響DNA的質量及純度?另外次生代謝產物中的酚類化合物可導致DNA降解,抑制限制酶?連接酶及DNA聚合酶等酶類的生物活性,從而影響后續的分析檢測[2,6]?

目前,對苧麻基因組DNA提取的研究大都選用幼嫩葉片[7-10]?種子萌發期黃化苗[7]等組織,而對最有研究價值的苧麻纖維組織基因組DNA提取至今僅有極少的報道[11],因此本研究選用3種不同方法(CTAB法?SDS法?尿素法)提取苧麻成熟期纖維韌皮組織?種子?根組織的基因組DNA,比較提取效果,以期獲得最佳的不同苧麻組織基因組DNA提取方法?

1材料與方法

1.1試驗材料

苧麻品種為中苧1號,樣品采于湖北新農生態麻業有限公司?取同株苧麻纖維成熟期的韌皮組織?種子?根組織?韌皮纖維組織用酒精棉球擦拭處理,種子和根組織用滅菌生理鹽水沖洗?酒精棉球擦拭處理,各組織處理完畢置于液氮內冷凍后,-70 ℃保存備用?

1.2試劑配方

1.2.1CTAB提取液稱取1.211 g Tris-Base,8.19 g NaCl,0.7 44 4 g EDTA,2.0 g CTAB溶于100 mL去離子水中,再加入5 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP),3 mL β-巰基乙醇,40 ℃水浴溶解?

1.2.2SDS提取液稱取1.211 g Tris-Base,2.925 g NaCl,1.816 g EDTA,1.5 g SDS溶于100 mL去離子水中,再加入5 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP),3 mL β-巰基乙醇 ,40 ℃水浴溶解?

1.2.3尿素提取液稱取0.048 g尿素,2.047 g NaCl,1.861 g EDTA溶于100 mL去離子水中,再加入5 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP),3 mL β-巰基乙醇,40 ℃水浴溶解?

1.3苧麻DNA的提取

1.3.1試驗設計方案試驗設計方案及所提取DNA的編號見表1?

1.3.2CTAB法

1)將1 g冰凍苧麻韌皮纖維組織放入盛有液氮的研缽中,用研杵將其磨成粉末,研磨過程不斷添加液氮以保持組織冷凍?

2)把組織粉末轉移至Eppendorf管中,每1 g組織加3.0 mL CTAB提取液,用勻漿器充分研磨,轉入離心管,于65 ℃水浴鍋中保溫約20 min(種子和根組織進行相同處理)?

3)待樣品冷卻至室溫后加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)溶液混勻,輕輕顛倒幾次離心管使管內混合物成為乳濁液,常溫下10 000 r/min離心10 min,取上清液轉入另一干凈離心管中?

4)重復步驟3一次?

5)取步驟4上清液加入2.5倍體積無水乙醇,仔細混勻,于冰箱中-20 ℃冷藏30 min以上,沉淀DNA,于4 ℃下12 000 r/min離心10 min?

6)棄去上層有機溶劑,加入500 μL 75 %乙醇洗滌沉淀,4 ℃下10 000 r/min離心5 min棄去上清,洗滌沉淀3次?

7)倒置或者37 ℃培養箱中烘干,3種DNA提取物分別標號C1?C2?C3?

8)加入50 μL去離子水溶解DNA,于-20 ℃冷藏備用?

1.3.3SDS法

1)同“1.3.2”中CTAB法步驟1?

2)把粉末轉移至Eppendorf管中,每1 g組織加3.0 mL的SDS提取液,用勻漿器充分研磨,轉入離心管,于65 ℃水浴鍋中保溫約20 min(種子和根組織進行相同處理)?

3)再加入200 μL 5 mol/L KAC,冰浴20 min?

4)同“1.3.2”中CTAB法步驟3?

5)重復步驟4?

6)取步驟5的上清液加入2.5倍體積無水乙醇,仔細混勻,于冰箱中-20 ℃冷藏30 min以上,沉淀DNA,再于4 ℃下12 000 r/min離心10 min?

7)同“1.3.2”中CTAB法步驟6?

8)倒置或者37 ℃培養箱中烘干,3種DNA提取物分別標號S1?S2?S3?

9)同1.3.2中CTAB法步驟8?

1.3.4尿素法

1)同“1.3.2”中CTAB法步驟1?

2)把粉末轉移到Eppendorf管中,每1 g組織加3.0 mL的尿素提取液,用勻漿器充分研磨,轉入離心管,于65 ℃水浴鍋中保溫約20 min(種子和根組織進行相同處理)?

3)同“1.3.2”中CTAB法步驟3?

4)重復步驟3一次?

5)取步驟4上清液加入2.5倍體積無水乙醇,仔細混勻,于冰箱中-20 ℃冷藏30 min以上,沉淀DNA,再于4 ℃下12 000 r/min離心10 min?

6)同“1.3.2”中CTAB法步驟6?

7)倒置或者于37 ℃培養箱中烘干,3種DNA提取物分別標號N1?N2?N3?

8)同“1.3.2”中CTAB法步驟8?

1.4不同研磨時間對DNA提取質量的影響

本試驗選用兩種DNA提取液(CTAB和SDS提取液)對兩種苧麻組織(纖維成熟期的韌皮組織?種子)進行不同研磨時間(2?4?6 min)的處理,操作方法及步驟同“1.3”中CTAB法和SDS法,比較研磨處理時間對提取出的DNA質量的影響?試驗設計及所提取的DNA編號見表2?

1.5提取DNA的質量檢測

1.5.1瓊脂糖凝膠電泳法配制1.0%瓊脂糖凝膠,苧麻總DNA上樣量為5 μL,在0.5×TEB緩沖液中,電壓100 V電泳15 min,在凝膠成像系統上觀察并拍照?

1.5.2紫外分光光度法取10 μL DNA,加TE溶液稀釋200倍,測定DNA OD260 nm和OD280 nm,以檢測DNA的濃度和純度?

2結果與分析

2.1不同方法對苧麻組織DNA提取質量的影響

同一組織不同方法提取的DNA瓊脂糖凝膠電泳對照結果見圖1?由圖1可見,CTAB法提取的DNA條帶最清晰,SDS法的DNA條帶次之,尿素法的條帶最模糊?3種方法提取的纖維成熟期韌皮組織的DNA質量均比其他兩種組織提取的DNA質量好,其中SDS法優于CTAB法和尿素法,CTAB法提取的種子DNA質量優于其他兩種方法,3種方法提取的根組織DNA質量沒有明顯差異?

紫外分光光度法檢測結果見表3?由表3可見,CTAB法提取的纖維成熟期韌皮組織總DNA的OD260 nm/OD280 nm比值大于2,種子和根組織總DNA的OD260 nm/OD280 nm分別為1.97和1.83,均介于1.8~2.0,總體最優?SDS法和尿素法提取的3種組織總DNA的OD260 nm/OD280 nm比值均小于1.8,說明含有蛋白質或者酚類物質,二者比較,尿素法稍好于SDS法?3種組織比較,纖維成熟期韌皮組織的總DNA質量最好,種子和根組織的DNA質量差別不大?

由表3可見,取等質量不同組織的材料,加入等量的提取緩沖液,CTAB法提取的DNA總量高于SDS法和尿素法提取的量,尿素法提取的種子和根組織的DNA總量高于SDS法提取的量,SDS法提取的纖維成熟期韌皮組織的DNA總量高于尿素法提取的量?對比3種組織DNA提取量,種子>纖維成熟期韌皮組織>根組織?

2.2不同研磨時間對組織DNA提取質量的影響

兩種組織不同研磨時間提取的DNA的瓊脂糖凝膠電泳結果見圖2?由圖2可見,CTAB法的條帶較SDS法的條帶更為清晰明亮?不同研磨時間對纖維成熟期韌皮組織DNA質量無明顯影響,對種子的DNA質量有較明顯的影響,研磨時間越長提取的DNA質量越高?

由表4可知,CTAB法提取的纖維成熟期韌皮組織DNA質量稍優于SDS法,而SDS法提取的DNA濃度遠高于CTAB法?從研磨時間來看,纖維成熟期韌皮組織研磨4 min提取的DNA(C2)質量最優,種子研磨6 min提取的DNA(S3)質量較好?

3小結與討論

對比不同方法提取的苧麻不同組織總DNA質量,CTAB法提取的DNA瓊脂糖凝膠電泳條帶較為清晰,DNA質量最好,其次是SDS法,尿素法提取的DNA質量較差?對比不同苧麻組織提取的總DNA質量,纖維成熟期韌皮組織中提取的DNA質量最好,種子和根組織提取的DNA質量差別不大?對比不同組織提取的總DNA濃度,種子提取的DNA濃度最高,其次是韌皮組織和根組織,這可能與不同植物組織的細胞含量差異有關?綜上所述,用CTAB法提取的DNA質量最好,適用于提取苧麻基因組DNA?

由于不同植物組織結構的差異,排除人為操作等外界因素,在提取總DNA過程中對研磨時間有不同的要求?本研究表明韌皮組織研磨4 min,種子研磨6 min時,提取的DNA質量較好?苧麻韌皮組織具有較高的纖維含量,研磨時間短導致細胞破裂不充分,影響DNA的得率,研磨時間過長,組織中所含的糖類等內含物會與DNA一起釋放出來,影響DNA的質量?種子由于細胞含量較多故較韌皮組織需要更長的研磨時間,其次較多的細胞數量也是種子DNA濃度較大的主要原因?該研究結果為苧麻不同組織總DNA的提取和利用奠定了基礎?

參考文獻:

[1] 喻春明,張彥紅,朱愛國,等.苧麻種質資源纖維結晶度變異及其主要品質性狀的關聯分析[J].中國麻業科學,2011,33(5):223-231.

[2] 易慶平,羅正榮,張青林.植物總基因組DNA提取純化方法綜述[J].安徽農業科學,2007,35(25):7789-7791.

[3] 李藝,鐵雙貴,朱衛紅,等.快速CTAB法提取玉米種子胚基因組DNA[J].河南農業科學,2008(2):17-20.

[4] 單志,吳宏亮,李成磊,等.改良SDS法提取多種植物基因組DNA研究[J].廣東農業科學,2011(8):113-115.

[5] 曹文波,鄭璐璐,謝文海.一種提取植物基因組DNA的方法—改良尿素法[J].華中師范大學學報(自然科學版),2008,4(3):448-451.

[6] 張寧,王鳳山.DNA提取方法進展[J].中國海洋藥物,2004(2):40-46.

[7] 郭新波,臧鞏固,趙立寧,等.苧麻野生近緣種植物基因組DNA提取技術的改進[J].中國麻業科學,2008,30(1):28-32.

[8] 邱財生,程超華,趙立寧,等.用RAPD標記研究苧麻屬植物的親緣關系[J].湖北農業科學,2011,50(7):1499-1501.

[9] 侯思名,段繼強,梁雪妮,等.苧麻總DNA提取的CTAB法優化方案[J].西北植物學報,2005,25(11):2193-2197.

[10] 黃小英,劉瑛,賴小萍,等.一種適提取野生苧麻總DNA的方法[J].中國野生植物資源,2002,21(1):56-57.

[11] 陳平,譚龍濤,喻春明,等.一種適用于PCR檢測的苧麻陳麻原麻DNA提取方法[J].中國麻業科學,2012,34(6):249-251.

1.2.3尿素提取液稱取0.048 g尿素,2.047 g NaCl,1.861 g EDTA溶于100 mL去離子水中,再加入5 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP),3 mL β-巰基乙醇,40 ℃水浴溶解?

1.3苧麻DNA的提取

1.3.1試驗設計方案試驗設計方案及所提取DNA的編號見表1?

1.3.2CTAB法

1)將1 g冰凍苧麻韌皮纖維組織放入盛有液氮的研缽中,用研杵將其磨成粉末,研磨過程不斷添加液氮以保持組織冷凍?

2)把組織粉末轉移至Eppendorf管中,每1 g組織加3.0 mL CTAB提取液,用勻漿器充分研磨,轉入離心管,于65 ℃水浴鍋中保溫約20 min(種子和根組織進行相同處理)?

3)待樣品冷卻至室溫后加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)溶液混勻,輕輕顛倒幾次離心管使管內混合物成為乳濁液,常溫下10 000 r/min離心10 min,取上清液轉入另一干凈離心管中?

4)重復步驟3一次?

5)取步驟4上清液加入2.5倍體積無水乙醇,仔細混勻,于冰箱中-20 ℃冷藏30 min以上,沉淀DNA,于4 ℃下12 000 r/min離心10 min?

6)棄去上層有機溶劑,加入500 μL 75 %乙醇洗滌沉淀,4 ℃下10 000 r/min離心5 min棄去上清,洗滌沉淀3次?

7)倒置或者37 ℃培養箱中烘干,3種DNA提取物分別標號C1?C2?C3?

8)加入50 μL去離子水溶解DNA,于-20 ℃冷藏備用?

1.3.3SDS法

1)同“1.3.2”中CTAB法步驟1?

2)把粉末轉移至Eppendorf管中,每1 g組織加3.0 mL的SDS提取液,用勻漿器充分研磨,轉入離心管,于65 ℃水浴鍋中保溫約20 min(種子和根組織進行相同處理)?

3)再加入200 μL 5 mol/L KAC,冰浴20 min?

4)同“1.3.2”中CTAB法步驟3?

5)重復步驟4?

6)取步驟5的上清液加入2.5倍體積無水乙醇,仔細混勻,于冰箱中-20 ℃冷藏30 min以上,沉淀DNA,再于4 ℃下12 000 r/min離心10 min?

7)同“1.3.2”中CTAB法步驟6?

8)倒置或者37 ℃培養箱中烘干,3種DNA提取物分別標號S1?S2?S3?

9)同1.3.2中CTAB法步驟8?

1.3.4尿素法

1)同“1.3.2”中CTAB法步驟1?

2)把粉末轉移到Eppendorf管中,每1 g組織加3.0 mL的尿素提取液,用勻漿器充分研磨,轉入離心管,于65 ℃水浴鍋中保溫約20 min(種子和根組織進行相同處理)?

3)同“1.3.2”中CTAB法步驟3?

4)重復步驟3一次?

5)取步驟4上清液加入2.5倍體積無水乙醇,仔細混勻,于冰箱中-20 ℃冷藏30 min以上,沉淀DNA,再于4 ℃下12 000 r/min離心10 min?

6)同“1.3.2”中CTAB法步驟6?

7)倒置或者于37 ℃培養箱中烘干,3種DNA提取物分別標號N1?N2?N3?

8)同“1.3.2”中CTAB法步驟8?

1.4不同研磨時間對DNA提取質量的影響

本試驗選用兩種DNA提取液(CTAB和SDS提取液)對兩種苧麻組織(纖維成熟期的韌皮組織?種子)進行不同研磨時間(2?4?6 min)的處理,操作方法及步驟同“1.3”中CTAB法和SDS法,比較研磨處理時間對提取出的DNA質量的影響?試驗設計及所提取的DNA編號見表2?

1.5提取DNA的質量檢測

1.5.1瓊脂糖凝膠電泳法配制1.0%瓊脂糖凝膠,苧麻總DNA上樣量為5 μL,在0.5×TEB緩沖液中,電壓100 V電泳15 min,在凝膠成像系統上觀察并拍照?

1.5.2紫外分光光度法取10 μL DNA,加TE溶液稀釋200倍,測定DNA OD260 nm和OD280 nm,以檢測DNA的濃度和純度?

2結果與分析

2.1不同方法對苧麻組織DNA提取質量的影響

同一組織不同方法提取的DNA瓊脂糖凝膠電泳對照結果見圖1?由圖1可見,CTAB法提取的DNA條帶最清晰,SDS法的DNA條帶次之,尿素法的條帶最模糊?3種方法提取的纖維成熟期韌皮組織的DNA質量均比其他兩種組織提取的DNA質量好,其中SDS法優于CTAB法和尿素法,CTAB法提取的種子DNA質量優于其他兩種方法,3種方法提取的根組織DNA質量沒有明顯差異?

紫外分光光度法檢測結果見表3?由表3可見,CTAB法提取的纖維成熟期韌皮組織總DNA的OD260 nm/OD280 nm比值大于2,種子和根組織總DNA的OD260 nm/OD280 nm分別為1.97和1.83,均介于1.8~2.0,總體最優?SDS法和尿素法提取的3種組織總DNA的OD260 nm/OD280 nm比值均小于1.8,說明含有蛋白質或者酚類物質,二者比較,尿素法稍好于SDS法?3種組織比較,纖維成熟期韌皮組織的總DNA質量最好,種子和根組織的DNA質量差別不大?

由表3可見,取等質量不同組織的材料,加入等量的提取緩沖液,CTAB法提取的DNA總量高于SDS法和尿素法提取的量,尿素法提取的種子和根組織的DNA總量高于SDS法提取的量,SDS法提取的纖維成熟期韌皮組織的DNA總量高于尿素法提取的量?對比3種組織DNA提取量,種子>纖維成熟期韌皮組織>根組織?

2.2不同研磨時間對組織DNA提取質量的影響

兩種組織不同研磨時間提取的DNA的瓊脂糖凝膠電泳結果見圖2?由圖2可見,CTAB法的條帶較SDS法的條帶更為清晰明亮?不同研磨時間對纖維成熟期韌皮組織DNA質量無明顯影響,對種子的DNA質量有較明顯的影響,研磨時間越長提取的DNA質量越高?

由表4可知,CTAB法提取的纖維成熟期韌皮組織DNA質量稍優于SDS法,而SDS法提取的DNA濃度遠高于CTAB法?從研磨時間來看,纖維成熟期韌皮組織研磨4 min提取的DNA(C2)質量最優,種子研磨6 min提取的DNA(S3)質量較好?

3小結與討論

對比不同方法提取的苧麻不同組織總DNA質量,CTAB法提取的DNA瓊脂糖凝膠電泳條帶較為清晰,DNA質量最好,其次是SDS法,尿素法提取的DNA質量較差?對比不同苧麻組織提取的總DNA質量,纖維成熟期韌皮組織中提取的DNA質量最好,種子和根組織提取的DNA質量差別不大?對比不同組織提取的總DNA濃度,種子提取的DNA濃度最高,其次是韌皮組織和根組織,這可能與不同植物組織的細胞含量差異有關?綜上所述,用CTAB法提取的DNA質量最好,適用于提取苧麻基因組DNA?

由于不同植物組織結構的差異,排除人為操作等外界因素,在提取總DNA過程中對研磨時間有不同的要求?本研究表明韌皮組織研磨4 min,種子研磨6 min時,提取的DNA質量較好?苧麻韌皮組織具有較高的纖維含量,研磨時間短導致細胞破裂不充分,影響DNA的得率,研磨時間過長,組織中所含的糖類等內含物會與DNA一起釋放出來,影響DNA的質量?種子由于細胞含量較多故較韌皮組織需要更長的研磨時間,其次較多的細胞數量也是種子DNA濃度較大的主要原因?該研究結果為苧麻不同組織總DNA的提取和利用奠定了基礎?

參考文獻:

[1] 喻春明,張彥紅,朱愛國,等.苧麻種質資源纖維結晶度變異及其主要品質性狀的關聯分析[J].中國麻業科學,2011,33(5):223-231.

[2] 易慶平,羅正榮,張青林.植物總基因組DNA提取純化方法綜述[J].安徽農業科學,2007,35(25):7789-7791.

[3] 李藝,鐵雙貴,朱衛紅,等.快速CTAB法提取玉米種子胚基因組DNA[J].河南農業科學,2008(2):17-20.

[4] 單志,吳宏亮,李成磊,等.改良SDS法提取多種植物基因組DNA研究[J].廣東農業科學,2011(8):113-115.

[5] 曹文波,鄭璐璐,謝文海.一種提取植物基因組DNA的方法—改良尿素法[J].華中師范大學學報(自然科學版),2008,4(3):448-451.

[6] 張寧,王鳳山.DNA提取方法進展[J].中國海洋藥物,2004(2):40-46.

[7] 郭新波,臧鞏固,趙立寧,等.苧麻野生近緣種植物基因組DNA提取技術的改進[J].中國麻業科學,2008,30(1):28-32.

[8] 邱財生,程超華,趙立寧,等.用RAPD標記研究苧麻屬植物的親緣關系[J].湖北農業科學,2011,50(7):1499-1501.

[9] 侯思名,段繼強,梁雪妮,等.苧麻總DNA提取的CTAB法優化方案[J].西北植物學報,2005,25(11):2193-2197.

[10] 黃小英,劉瑛,賴小萍,等.一種適提取野生苧麻總DNA的方法[J].中國野生植物資源,2002,21(1):56-57.

[11] 陳平,譚龍濤,喻春明,等.一種適用于PCR檢測的苧麻陳麻原麻DNA提取方法[J].中國麻業科學,2012,34(6):249-251.

1.2.3尿素提取液稱取0.048 g尿素,2.047 g NaCl,1.861 g EDTA溶于100 mL去離子水中,再加入5 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP),3 mL β-巰基乙醇,40 ℃水浴溶解?

1.3苧麻DNA的提取

1.3.1試驗設計方案試驗設計方案及所提取DNA的編號見表1?

1.3.2CTAB法

1)將1 g冰凍苧麻韌皮纖維組織放入盛有液氮的研缽中,用研杵將其磨成粉末,研磨過程不斷添加液氮以保持組織冷凍?

2)把組織粉末轉移至Eppendorf管中,每1 g組織加3.0 mL CTAB提取液,用勻漿器充分研磨,轉入離心管,于65 ℃水浴鍋中保溫約20 min(種子和根組織進行相同處理)?

3)待樣品冷卻至室溫后加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)溶液混勻,輕輕顛倒幾次離心管使管內混合物成為乳濁液,常溫下10 000 r/min離心10 min,取上清液轉入另一干凈離心管中?

4)重復步驟3一次?

5)取步驟4上清液加入2.5倍體積無水乙醇,仔細混勻,于冰箱中-20 ℃冷藏30 min以上,沉淀DNA,于4 ℃下12 000 r/min離心10 min?

6)棄去上層有機溶劑,加入500 μL 75 %乙醇洗滌沉淀,4 ℃下10 000 r/min離心5 min棄去上清,洗滌沉淀3次?

7)倒置或者37 ℃培養箱中烘干,3種DNA提取物分別標號C1?C2?C3?

8)加入50 μL去離子水溶解DNA,于-20 ℃冷藏備用?

1.3.3SDS法

1)同“1.3.2”中CTAB法步驟1?

2)把粉末轉移至Eppendorf管中,每1 g組織加3.0 mL的SDS提取液,用勻漿器充分研磨,轉入離心管,于65 ℃水浴鍋中保溫約20 min(種子和根組織進行相同處理)?

3)再加入200 μL 5 mol/L KAC,冰浴20 min?

4)同“1.3.2”中CTAB法步驟3?

5)重復步驟4?

6)取步驟5的上清液加入2.5倍體積無水乙醇,仔細混勻,于冰箱中-20 ℃冷藏30 min以上,沉淀DNA,再于4 ℃下12 000 r/min離心10 min?

7)同“1.3.2”中CTAB法步驟6?

8)倒置或者37 ℃培養箱中烘干,3種DNA提取物分別標號S1?S2?S3?

9)同1.3.2中CTAB法步驟8?

1.3.4尿素法

1)同“1.3.2”中CTAB法步驟1?

2)把粉末轉移到Eppendorf管中,每1 g組織加3.0 mL的尿素提取液,用勻漿器充分研磨,轉入離心管,于65 ℃水浴鍋中保溫約20 min(種子和根組織進行相同處理)?

3)同“1.3.2”中CTAB法步驟3?

4)重復步驟3一次?

5)取步驟4上清液加入2.5倍體積無水乙醇,仔細混勻,于冰箱中-20 ℃冷藏30 min以上,沉淀DNA,再于4 ℃下12 000 r/min離心10 min?

6)同“1.3.2”中CTAB法步驟6?

7)倒置或者于37 ℃培養箱中烘干,3種DNA提取物分別標號N1?N2?N3?

8)同“1.3.2”中CTAB法步驟8?

1.4不同研磨時間對DNA提取質量的影響

本試驗選用兩種DNA提取液(CTAB和SDS提取液)對兩種苧麻組織(纖維成熟期的韌皮組織?種子)進行不同研磨時間(2?4?6 min)的處理,操作方法及步驟同“1.3”中CTAB法和SDS法,比較研磨處理時間對提取出的DNA質量的影響?試驗設計及所提取的DNA編號見表2?

1.5提取DNA的質量檢測

1.5.1瓊脂糖凝膠電泳法配制1.0%瓊脂糖凝膠,苧麻總DNA上樣量為5 μL,在0.5×TEB緩沖液中,電壓100 V電泳15 min,在凝膠成像系統上觀察并拍照?

1.5.2紫外分光光度法取10 μL DNA,加TE溶液稀釋200倍,測定DNA OD260 nm和OD280 nm,以檢測DNA的濃度和純度?

2結果與分析

2.1不同方法對苧麻組織DNA提取質量的影響

同一組織不同方法提取的DNA瓊脂糖凝膠電泳對照結果見圖1?由圖1可見,CTAB法提取的DNA條帶最清晰,SDS法的DNA條帶次之,尿素法的條帶最模糊?3種方法提取的纖維成熟期韌皮組織的DNA質量均比其他兩種組織提取的DNA質量好,其中SDS法優于CTAB法和尿素法,CTAB法提取的種子DNA質量優于其他兩種方法,3種方法提取的根組織DNA質量沒有明顯差異?

紫外分光光度法檢測結果見表3?由表3可見,CTAB法提取的纖維成熟期韌皮組織總DNA的OD260 nm/OD280 nm比值大于2,種子和根組織總DNA的OD260 nm/OD280 nm分別為1.97和1.83,均介于1.8~2.0,總體最優?SDS法和尿素法提取的3種組織總DNA的OD260 nm/OD280 nm比值均小于1.8,說明含有蛋白質或者酚類物質,二者比較,尿素法稍好于SDS法?3種組織比較,纖維成熟期韌皮組織的總DNA質量最好,種子和根組織的DNA質量差別不大?

由表3可見,取等質量不同組織的材料,加入等量的提取緩沖液,CTAB法提取的DNA總量高于SDS法和尿素法提取的量,尿素法提取的種子和根組織的DNA總量高于SDS法提取的量,SDS法提取的纖維成熟期韌皮組織的DNA總量高于尿素法提取的量?對比3種組織DNA提取量,種子>纖維成熟期韌皮組織>根組織?

2.2不同研磨時間對組織DNA提取質量的影響

兩種組織不同研磨時間提取的DNA的瓊脂糖凝膠電泳結果見圖2?由圖2可見,CTAB法的條帶較SDS法的條帶更為清晰明亮?不同研磨時間對纖維成熟期韌皮組織DNA質量無明顯影響,對種子的DNA質量有較明顯的影響,研磨時間越長提取的DNA質量越高?

由表4可知,CTAB法提取的纖維成熟期韌皮組織DNA質量稍優于SDS法,而SDS法提取的DNA濃度遠高于CTAB法?從研磨時間來看,纖維成熟期韌皮組織研磨4 min提取的DNA(C2)質量最優,種子研磨6 min提取的DNA(S3)質量較好?

3小結與討論

對比不同方法提取的苧麻不同組織總DNA質量,CTAB法提取的DNA瓊脂糖凝膠電泳條帶較為清晰,DNA質量最好,其次是SDS法,尿素法提取的DNA質量較差?對比不同苧麻組織提取的總DNA質量,纖維成熟期韌皮組織中提取的DNA質量最好,種子和根組織提取的DNA質量差別不大?對比不同組織提取的總DNA濃度,種子提取的DNA濃度最高,其次是韌皮組織和根組織,這可能與不同植物組織的細胞含量差異有關?綜上所述,用CTAB法提取的DNA質量最好,適用于提取苧麻基因組DNA?

由于不同植物組織結構的差異,排除人為操作等外界因素,在提取總DNA過程中對研磨時間有不同的要求?本研究表明韌皮組織研磨4 min,種子研磨6 min時,提取的DNA質量較好?苧麻韌皮組織具有較高的纖維含量,研磨時間短導致細胞破裂不充分,影響DNA的得率,研磨時間過長,組織中所含的糖類等內含物會與DNA一起釋放出來,影響DNA的質量?種子由于細胞含量較多故較韌皮組織需要更長的研磨時間,其次較多的細胞數量也是種子DNA濃度較大的主要原因?該研究結果為苧麻不同組織總DNA的提取和利用奠定了基礎?

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