發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸的研究進展

黃國昌，熊大維，張 婷，邱小忠

(江西省科學院微生物研究所，330096，南昌)

發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸的研究進展

黃國昌，熊大維，張 婷，邱小忠

(江西省科學院微生物研究所，330096，南昌)

綜述了國內(nèi)外關(guān)于發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸的現(xiàn)狀，介紹了乳酸生產(chǎn)菌株篩選、誘變和基因工程育種及乳酸的發(fā)酵工藝的研究進展，并展望了廢棄物作為原料用于乳酸發(fā)酵的前景。

乳酸；發(fā)酵；工藝；提取

0 引言

自1780年瑞典化學家Scheele發(fā)現(xiàn)乳酸以來，乳酸及其衍生物在食品、醫(yī)藥、輕工、化工及農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。近年來，隨著乳酸在食品、飲料和化妝品行業(yè)的大量使用，以及作為原料在聚乳酸工業(yè)生產(chǎn)中需求量的增大，乳酸在全球的生產(chǎn)量已超越檸檬酸和乙酸，位居第1。本文對國內(nèi)外關(guān)于發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸的現(xiàn)狀進行了綜述，并介紹了乳酸高產(chǎn)菌株的選育和有關(guān)發(fā)酵工藝的研究進展，以期為乳酸發(fā)酵生產(chǎn)和研究提供參考。

1 乳酸的國內(nèi)外生產(chǎn)現(xiàn)狀

到2008年為止，全球乳酸的總生產(chǎn)能力約為65萬t/a，年產(chǎn)量約為37萬t，主要生產(chǎn)地區(qū)為美國、西歐、日本和中國等地(表1)，近90%的生產(chǎn)廠家采用發(fā)酵法進行生產(chǎn)。在今后幾年內(nèi)，隨著生產(chǎn)成本的降低，聚乳酸市場的不斷擴大，乳酸產(chǎn)品的年需求將達到200～300萬t[1]。

據(jù)CCM(China Chemicals Market，中國化工市場)調(diào)查，聚乳酸的消耗量已經(jīng)超過了食品和飲料產(chǎn)業(yè)，成為全球乳酸的主要市場。然而，在中國，食品和飲料一直是重要的消費領(lǐng)域，占中國總消費的75.28%。在日本，化妝品和食品添加劑乳酸的消費量，占到乳酸總消費量的86%。預(yù)計2011-2015年，北美、日本和歐洲的生物可降解塑料將以超過6%的年增長率增長；在歐洲，2015年用于工業(yè)的生物可降解塑料預(yù)計達到6 700 t[2]。

世界領(lǐng)先的乳酸生產(chǎn)企業(yè)包括Archer Daniels Midland、CSM NV、Purac、Galactic SA、 Musashino Chemical Laboratory、Ltd(株式會社武藏野化學研究所)、河南金丹乳酸有限公司、武藏野化學(中國)有限公司、安徽豐原生物化學股份有限公司，后三者占據(jù)了國內(nèi)乳酸市場的90%，其中河南金丹乳酸有限公司具有年產(chǎn)8 萬t乳酸及系列產(chǎn)品的生產(chǎn)能力，生產(chǎn)規(guī)模居世界第2位、亞洲第1位，其中DL-乳酸產(chǎn)量居世界首位，是國內(nèi)最大的乳酸生產(chǎn)和出口創(chuàng)匯基地[3]，然而D-乳酸生產(chǎn)廠家僅有2～3家，且規(guī)模較小。

表1 2008年全球各地區(qū)乳酸的產(chǎn)量和消費量/萬t·a-1

表2 2008年、2013年全球乳酸消費結(jié)構(gòu)/萬t

2 發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸的研究進展

發(fā)酵法生產(chǎn)L-乳酸常用的微生物主要有乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)和根霉菌(Rhizopussp.)，而產(chǎn)光學純D-乳酸的生產(chǎn)菌株主要分布在乳桿菌屬(Lactobacillus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、芽孢乳桿菌屬(Sporolactobacillus)和明串珠菌屬(Leuconostoc)等4個菌屬。有關(guān)發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸的研究目前主要集中在以下方面。

2.1菌種選育

L-乳酸的傳統(tǒng)發(fā)酵菌種主要為米根霉，國內(nèi)外報道了不同的方法用于米根霉育種。表3列舉了對米根霉進行誘變選育的主要方法及突變株發(fā)酵乳酸的情況。

由于細菌發(fā)酵具有更高的得率和轉(zhuǎn)化率，細菌厭氧發(fā)酵可大規(guī)模降低能耗，減少乳酸的生產(chǎn)成本，因此細菌發(fā)酵L-乳酸逐漸成為國內(nèi)外近年來研究的熱點。

DNA重組技術(shù)由于能對目標基因精確的進行遺傳學操作，改變菌種的代謝途徑，增加目標產(chǎn)物的產(chǎn)量，減少副產(chǎn)物的產(chǎn)生，并且能將目標基因轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)要求簡單的菌株中，從而簡化發(fā)酵工藝。Skory[12]首次將米根霉的乳酸脫氫酶基因在酵母菌中表達，又通過提高乳酸脫氫酶活性來提高米根霉的產(chǎn)酸能力，發(fā)現(xiàn)帶有較長基因片段的質(zhì)粒明顯比帶較短基因片段質(zhì)粒的產(chǎn)酸量高；ZHOU[13]等去除了大腸桿菌中的甲酸裂解酶(pyr-uvate formatelyase,pflB)、乙酸激酶(acetate kinase,ackA)、乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,adhE)和延胡索酸還原酶(fumarate reductase,frdBC)4個基因后，將乳酸片球菌中的L型乳酸脫氫酶替換大腸桿菌本身的D型乳酸脫氫酶，構(gòu)建出轉(zhuǎn)化率高、L-乳酸純度高的大腸桿菌基因工程菌。Chang[14]等在突變了磷酸轉(zhuǎn)乙酰化酶(phosphotransacetylase,pta)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenol-pyruvate carboxylase,ppc)后，也得到了乳酸的高產(chǎn)菌株；Nikkila[15]等采用ldhD (D-乳酸脫氫酶)基因缺失策略，通過同源重組的基因替換方法構(gòu)建了2株穩(wěn)定的德氏乳桿菌工程菌。其中一株通過ldhD基因的啟動子缺失阻止ldhD基因轉(zhuǎn)錄，另一株用ldhL基因代替ldhD基因，發(fā)現(xiàn)2株構(gòu)建菌株L-乳酸脫氫酶活性分別提高了53%和93%，且只生產(chǎn)L-乳酸，產(chǎn)量增加1倍，與野生型總產(chǎn)酸量相等；Porro[16]等將LDH基因?qū)肴笔П崦擊让富虻娜樗峥唆斁S酵母菌(Kluyveromyceslactis)PMI/CI中，重新構(gòu)建了酵母菌的細胞代謝途徑，由于缺乏丙酮酸脫羧酶基因，合成乙醇的代謝途徑受阻，代謝途徑流向乳酸合成，所得菌株產(chǎn)乳酸濃度為109 g/L，產(chǎn)率為0.9 g/(L·h)，轉(zhuǎn)化率為1.19 mol乳酸/mol葡萄糖。選擇酵母菌的優(yōu)點是可在比細菌更低的pH環(huán)境中生產(chǎn)有機酸。另外，在釀酒酵母菌中，Saitoh[17]等通過替換丙酮酸脫羧酶基因，發(fā)酵得到122 g/L高光學純度的L-乳酸。

表3 國內(nèi)外用于米根霉誘變育種的主要方式及誘變株發(fā)酵情況

表4 國內(nèi)外用于發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸細菌誘變的主要方法及誘變株發(fā)酵乳酸的情況

由于人體只有代謝L-乳酸的L-乳酸脫氫酶，L-乳酸作為食品添加劑等被廣泛使用，加之L-乳酸在聚乳酸工業(yè)合成中的應(yīng)用，L-乳酸的高產(chǎn)菌選育及高效生產(chǎn)工藝已得到高度的發(fā)展與開發(fā)，而D-乳酸的研究則相對較少。D-乳酸作為一個重要的手性中間體，已被用于多種手性物質(zhì)的合成。近年來高光學純度的D-乳酸因為在提高聚乳酸材料性能方面的實際應(yīng)用而得到了更多的關(guān)注。研究顯示PLLA(聚L-乳酸)和PDLA(聚D-乳酸)以1:1比例形成的共混PLLA/PDLA復合物因為PLLA和PDLA鏈間強烈的相互作用，其熔點(Tm)可以達到220～230 ℃，比純的PLLA或PDLA(170～180 ℃)高出約50 ℃。因此，D-乳酸生產(chǎn)菌的篩選和育種工作越來越被人們重視，表5所列為國內(nèi)外對D-乳酸生產(chǎn)菌的選育情況。

2.2發(fā)酵方式

發(fā)酵方式不同會直接影響菌體生長，對提高產(chǎn)物積累造成影響，目前菌種發(fā)酵方式有菌種固定化發(fā)酵、液體深層游離發(fā)酵等。楊子培[22]等利用玉米淀粉以米根霉(Rhizopusoryzae)TL-527-9作為發(fā)酵菌種進行深層發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)酸9.41 g/L，L-乳酸純度達98%以上；Yin[23]等在氣升式發(fā)酵罐內(nèi)用米根霉發(fā)酵玉米淀粉直接生產(chǎn)L-乳酸，得到乳酸質(zhì)量濃度為102 g/L，得率為85%。Goksungur[24]等用甲殼糖雜化海藻酸鹽對干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)NRRLB-441進行固定化并用來發(fā)酵L-乳酸，發(fā)現(xiàn)游離細胞數(shù)量比單用海藻酸鈣作為載體的減少了很多，同時乳酸產(chǎn)量也相應(yīng)有大幅增加；Tay[25]等則用棉布固定米根霉進行發(fā)酵，乳酸的產(chǎn)率接近100%；Sun[26]等使用了一種利用聚氨酯泡沫作為固定化載體的自然吸附方法對米根霉進行固定，發(fā)酵得率提高了2倍；李娟[27]等利用聚乙烯醇固定化米根霉，在投糖15%的情況下，L-乳酸產(chǎn)量提高了20%，達106.48 g/L；寧尚勇[28]等綜合固定床和膜反應(yīng)器的優(yōu)點，采用固定化細胞浸沒式膜生物反應(yīng)器技術(shù)實現(xiàn)乳酸的連續(xù)發(fā)酵，發(fā)酵液中乳酸最終濃度為73.1 g/L，為連續(xù)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

表5 D-乳酸生產(chǎn)菌的選育方法及生產(chǎn)能力比較

2.3發(fā)酵工藝

隨著發(fā)酵工藝的不斷發(fā)展，傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝(如分批發(fā)酵工藝、連續(xù)發(fā)酵工藝、固定化細胞反應(yīng)器工藝)越來越顯示出其弊端，新型發(fā)酵工藝如原位分離技術(shù)(in situ product removal，ISPR)得到了更多的嘗試。ISPR技術(shù)是利用一定裝置讓成熟發(fā)酵液流向后處理單元減少產(chǎn)物反饋抑制的同時，使菌體返回生物反應(yīng)器內(nèi)繼續(xù)使用，并適時排除衰老的細胞的工藝，包括電滲析發(fā)酵工藝、萃取發(fā)酵工藝、膜循環(huán)反應(yīng)器工藝等，對連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)的實現(xiàn)具有重要意義。

電滲析方法有許多優(yōu)點：1)不用中和劑就可控制pH值；2)減輕產(chǎn)物抑制；3)濃縮產(chǎn)物；4)簡化后提取工藝。但是微生物細胞會逐漸附著到陰離子膜上，導致膜電阻增大，電滲析效率下降。Nomura等對此進行了深入而全面的研究，發(fā)現(xiàn)固定化技術(shù)是解決這個問題的有效途徑。另外他們將中空纖維超濾膜和電滲析串聯(lián)使用，以避免細胞附著到離子交換膜上被殺死，取得了干細胞的重量增大，活性細胞數(shù)目增大，發(fā)酵周期縮短，間歇培養(yǎng)速度加快的理想效果；李學梅[29]等將電滲析發(fā)酵法應(yīng)用于米根霉發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸。由于米根霉的菌絲發(fā)達，發(fā)酵好氧，采用海藻酸鈣包埋法固定米根霉，在三相流化床生物反應(yīng)器中發(fā)酵，既可防止菌絲堵塞電滲析器，造成膜污染，又可解決傳統(tǒng)米根霉發(fā)酵中菌絲纏繞結(jié)團的問題。

萃取發(fā)酵是在發(fā)酵過程中利用有機溶劑連續(xù)萃取出發(fā)酵產(chǎn)物以消除產(chǎn)物抑制的耦合發(fā)酵技術(shù)。Kwon[30]等利用雙水相(aqueous two phase)提取法進行乳酸發(fā)酵，將聚乙二醇(PEG)水溶液和羥基醚纖維素(HEC)水溶液加入發(fā)酵液中使乳酸和菌體分離。而HEC對德氏乳桿菌(L.delb-rueckii)的生長無影響，而且雙水相提取與間歇發(fā)酵相比，生產(chǎn)量增大1.3倍，乳酸產(chǎn)量提高15%。Chen[31]推薦微孔中空纖維膜(microprous hollow fiber membrane,MHF)溶劑提取法，連續(xù)原位提取乳酸。陳敏[32]等在油醇和三辛胺混合溶劑為非常規(guī)介質(zhì)的反應(yīng)系統(tǒng)中，對德氏乳桿菌的乳酸萃取發(fā)酵條件進行了研究。

膜反應(yīng)器發(fā)酵將發(fā)酵和分離過程相結(jié)合，使發(fā)酵過程中保持了細胞的高濃度，細胞可循環(huán)使用，乳酸從發(fā)酵罐中連續(xù)移走，一方面可以減少pH調(diào)節(jié)劑的使用，減小因pH變化對產(chǎn)酸的影響，另一方面可以減少產(chǎn)物抑制作用，提高產(chǎn)率。Danner[33]等設(shè)計了超濾膜生物反應(yīng)器(MBR)單極電滲析箱(ED)，構(gòu)成MBR-ED單元操作系統(tǒng)，對從堆肥中篩選出來能利用己糖和戊糖的嗜熱脂肪芽孢桿菌BS119進行連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的研究。

2.4原料的選擇

乳酸發(fā)酵的原料除了傳統(tǒng)的葡萄糖、玉米淀粉、大米等原料外，世界各國的學者和機構(gòu)紛紛開始對非糧食作物、工農(nóng)林業(yè)廢棄物和生活垃圾等含糖原料進行乳酸發(fā)酵研究，既可以降低乳酸生產(chǎn)的成本，又能解決廢棄物的處理和污染問題，如美國的Cargill Dow公司已成功地利用玉米渣為原料來生產(chǎn)L-乳酸，再將L-乳酸制成生物可降解的聚L-乳酸。現(xiàn)將國內(nèi)外采用不同原料進行乳酸發(fā)酵的情況總結(jié)于表6。

工業(yè)廢棄物的成分復雜，發(fā)酵乳酸容易產(chǎn)生多種副產(chǎn)物，增加了提取和精制的難度，另外，對于纖維素和半纖維素類的農(nóng)林廢棄物轉(zhuǎn)化發(fā)酵乳酸雖有較多報道，也取得了一定進展，但仍難用于工業(yè)化生產(chǎn)。因此，近些年對纖維素的酶解、木糖轉(zhuǎn)化乳酸及乳酸發(fā)酵工藝等方面的研究越來越引起人們的關(guān)注。

表6 不同原料發(fā)酵乳酸研究情況

3 展望

隨著聚乳酸市場的不斷擴大，未來幾年內(nèi)，國際市場對乳酸的需求將急劇增長，而我國生產(chǎn)的乳酸主要以食品級的D,L-乳酸為主，高品質(zhì)的乳酸主要依賴進口，并且乳酸生產(chǎn)的成本較國外更高。因此，未來的研究應(yīng)更加深入對乳酸生產(chǎn)和精制工藝的改進，包括高產(chǎn)高光學純度乳酸菌的篩選，乳酸菌發(fā)酵代謝的研究，基因工程菌的構(gòu)建等；在發(fā)酵工藝方面，應(yīng)該更多考慮菌種固定化和發(fā)酵與提取耦合的工藝研究，降低生產(chǎn)成本，獲得更高品質(zhì)的乳酸。在面臨糧食安全及全球減排壓力的形勢下，對非糧食生物質(zhì)原料發(fā)酵乳酸的研究將會是近些年研究的熱點。此外，D-乳酸對提高聚乳酸的熱穩(wěn)定性等方面具有重要作用，市場對D-乳酸的需求也會日顯突出，而目前國內(nèi)外對D-乳酸的研究大多都處于小試階段，工業(yè)化生產(chǎn)D-乳酸的規(guī)模較小，D-乳酸的發(fā)酵因為營養(yǎng)要求比較復雜，仍有較多課題值得研究和探討。

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AdvancesinFermentationMethodsforLacticAcidProduction

HUANG Guochang,XIONG Dawei,ZHANG Ting,QIU Xiaozhong

(Jiangxi Academy of Science.Institute of Microbiology,330096,Nanchang,PRC)

Advances in the technology of lactic acid fermentation was reviewed in this paper.The breeding, mutation and genetic engineering breeding of lactic acid strain,as well as the technologies of fermentation were introduced,and the outlook of fermentation with waste material was also proposed.

lactic acid;fermentation;technology;extraction

2014-07-07;

2014-08-06

黃國昌(1981-)，男，江西撫州人，碩士，目前主要從事有機酸發(fā)酵和食品添加劑方面的研究工作。

10.13990/j.issn1001-3679.2014.05.019

TQ921+.3

A

1001-3679(2014)05-0660-07