HPLC法快速檢測生物樣品中溴敵隆

馬紅娟，徐志敏，楊 磊，劉小玲，李梅華，鐘菊花，馬錦琦

·法醫學·

HPLC法快速檢測生物樣品中溴敵隆

馬紅娟1，徐志敏2，楊 磊1，劉小玲1，李梅華1，鐘菊花1，馬錦琦1

目的通過HPLC建立一種快速、有效的溴敵隆含量檢測方法。方法分別采用甲醇、乙醇和丙酮提取血液檢材中的溴敵隆，通過改變萃取溶劑，考察回收率，使用HPLC檢測，比較提取效果。結果本法檢測生物檢材中的溴敵隆，在1～100 μg/mL時線性關系良好(相關系數R2=0.9973)；甲醇、乙醇和丙酮提取的加標平均回收率分別為78.5%，83.5% 和77.9%。結論本方法快速、有效，改進了生物檢材中溴敵隆含量檢測的法醫毒物分析方法，也可應用于中毒病人的早期診斷。

HPLC；溴敵隆；血液

溴敵隆是第二代抗凝血劑滅鼠藥，近年來雖有采用HPLC、LC-MS等方法檢驗溴敵隆，但是多為糧食、飼料等體外樣品。經動物體內代謝或經體內組織提取、檢測溴敵隆的方法少，且提取回收率較低，不能達到檢測要求[2]，本研究通過HPLC建立一種快速有效的溴敵隆含量檢測方法。

1 材料

1.1實驗儀器與試劑儀器：Waters高效液相色譜儀，配有1525二元泵和 2487 二極管陣列檢測器(美國 Waters 公司)；TG 328B 電光分析天平(上海天平儀器廠)；F8010AP無油真空泵(天津市科億隆實驗設備有限公司)。試劑：溴敵隆標準品(98.0%，德國Dr.公司)、甲醇、無水乙醇、丙酮均為HPLC級，磷酸、磷酸二氫鉀等均為分析純，實驗用水來自Milii-Q純水系統。實驗動物：小白鼠20只(LD50組7只、半LD50組7只、空白組6只)購自本校動物中心。

1.2樣品處理溴敵隆的小鼠LD50為0.21 mg/mL。實驗組分別以LD50組、1/2LD50組，用灌胃法灌入溴敵隆稀釋液，空白組灌喂生理鹽水各0.4 mL，1周后統一處死，解剖取肝組織、胃組織、靜脈血，對所得檢材以直接提取法，分別用甲醇、乙醇、丙酮提純萃取，萃取液濃縮、定容至500 μL。

1.3樣品檢測色譜條件：色譜柱為Symmetry?C18反相柱(4.6×150 mm，5 μm)；流動相：磷酸鹽緩沖液(pH=3)：甲醇=0.18∶0.82；紫外檢測波長：260 nm；進樣量：10 μL；柱溫：30℃。峰形良好，出峰時間為5 min左右，穩定性好[4]。

2 方法與結果

2.1標準曲線的繪制取溴敵隆標準品20 mg于容量瓶中，用無水乙醇定容至25 mL，得到濃度為0.8 mg/mL的儲備液。用此儲備液制成1、5、10、20、50、100 μg/mL的標準系列溶液，按照1.3條件進行測定，得到線性回歸方程y=32311x+45324(r2=0.9973)。在確定濃度范圍內，標準品溶液的濃度與峰面積成良好的線性關系。

2.2樣品測定進樣針準確抽取10 μL樣品處理液在1.3條件下HPLC法檢測，得到樣品液的出峰時間與峰面積，得出結果見表1。

表1 不同樣品中溴敵隆含量 μg/g

2.3精密度及回收率取空白血液添加溴敵隆標準品，分別用乙醇、甲醇、丙酮提取，提取液經檢測計算平均回收率分別為83.5%、78.5%、77.9%。對同一樣品重復檢測，得到相對標準差RSD<10%。測得最低檢測限16 ng/mL(s/n>3)。

2.4結論實驗結果表明，乙醇、甲醇、丙酮均可對溴敵隆進行提取，但血液、肝臟用乙醇提取的萃取率高于甲醇和丙酮。

2 討論

溴敵隆化學名是：3-(4-羥基-3-香豆素)-3-苯基-1-(對溴聯苯基)-丙醇-1，其對很多種動物都有很強的毒性，可以通過消化道、皮膚和呼吸道吸收而導致中毒。溴敵隆的結構與維生素K相似，可在肝臟中與維生素K競爭，抑制凝血酶原和凝血因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的生物合成，導致凝血障礙，其體內代謝產物亞芐基丙酮還可損害毛細血管壁，使其通透性增強，血液易滲出，導致大出血而死亡。其生物半衰期為6 d，最大效應在12～15 d，所以中毒后需要很長的治療時間(通常2～4周)[1]。由于它作用緩慢、不易引起鼠類警覺、易殲滅鼠害的特點，而且具有適口性好、毒力強、靶譜廣的特性，單劑量使用對各種鼠類都能有效防除。以此作為有效成分，配以溶劑、組溶劑及誘食劑等制成的滅鼠毒餌，常用于家庭、社區、公共場所等不同環境殺滅鼠害，容易發生誤食等情況。由于初期癥狀不明顯，常常被忽視，而不能盡早做出診斷，影響醫治。

溴敵隆作為一種使用頻繁、在機體內作用較慢的低毒鼠藥，常有小兒誤食等情況發生，其在中毒者體內含量不高，臨床上往往因不能盡早做出診斷而影響醫治。近年來雖有采用HPLC、LC-MS等方法檢驗溴敵隆，但是多為糧食、飼料等體外樣品，經動物體內代謝或經體內組織提取、檢測溴敵隆的方法很少。雖有齊孝蕊利用離子液體分散液相色譜微萃取技術提取檢測生物檢材中的溴敵隆[3]，但操作不易，不適宜快速檢測。臨床發生中毒事件后，常常需要在短時間內做出診斷，以利于盡早救治。本課題采用高效液相色譜法(HPLC)，用甲醇、乙醇、丙酮提純、萃取檢材，操作簡便易行，配合適當的色譜條件，乙醇的加標平均回收率為83.5%，滿足方法學要求，達到快速檢測的目的。且方法成本較小，成熟后可應用于中毒患者的早期診斷。

[1]董天義，顏丙申.三種新抗凝血劑鼠餌防制家棲鼠實驗室效果評價[J].醫學動物防制，2004，20(6)：333-337.

[2]趙海雨，宋鳴.HPLC-ESI-MS/MS法測定全血中溴敵隆[J].刑事技術，2008，(5)：16.

[3]齊孝蕊，周海梅，呂坪，等.離子液體分散液相微萃取-HPLC檢測血漿中溴敵隆[J].中國法醫學雜志，2013，28(4)：282-283.

QuickDetectionofBromadialoneofBiologicalSamplesbyHPLC

MA Hong-juan,YANG Lei,LIU Xiao-ling,et al

(College of Forensic Medicine,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

ObjectiveTo establish a rapid and effective method for determining the content of bromadialone in blood,investigating the recovery to obtain the best treatment condition during changing the extraction solvents.MethodsUsing the methanol,ethanol and acetone to extract the bromadialone in blood samples respectively,and then compared the results of extraction by HPLC.ResultsUnder the conditions of this method,the good linear relationship was obtained in the range of 1～100 μg/mL(R2=0.9973);the average recoveries of extraction with methanol,ethanol and acetone were 78.5%,83.5% and 77.9% respectively.ConclusionThis method is rapid and effective for the detection of bromadialone and the improvement for the forensic toxicology analysis of bromadialone in biological samples,and also can be used for the early diagnosis of poisoning patients.

HPLC；bromadiolone；blood

河南科技大學大學生研究訓練計劃(2013228)

2014-07-28

河南科技大學法醫學院，河南洛陽 471003

1.馬紅娟(1992-)，女，河南永城人，從事法醫毒化研究。 2.義馬市人民檢察院，河南義馬 472300

馬錦琦，男，高級實驗師，E-mail：hnrluccky@mail.haust.edu.cn

DF795.4

A

1672-688X(2014)03-0227-02