MAPK通路抑制劑對不同PTEN狀態(tài)子宮內(nèi)膜癌細胞作用及機制

肖 蘭，龍騰飛，何 嬋，周家德

MAPK通路抑制劑對不同PTEN狀態(tài)子宮內(nèi)膜癌細胞作用及機制

肖 蘭，龍騰飛，何 嬋，周家德

目的 探討PTEN缺失和表達下p38MAPK通路抑制劑（SB203580）對子宮內(nèi)膜癌細胞Ishikawa及HEC-1A的作用及其機制。方法 PTEN小分子干擾RNA及PTEN基因轉(zhuǎn)染后，激光共聚焦顯微鏡檢測PTEN蛋白表達;SB203580干預48 h，流式細胞術(shù)、MTT法及Western blot法分別檢測細胞干預后子宮內(nèi)膜癌細胞早期凋亡、細胞增殖活性、p38MAPK通路的磷酸化水平及其下游底物4E-BP1蛋白的磷酸化情況。結(jié)果 PTEN小分子干擾RNA封閉與PTEN穩(wěn)定轉(zhuǎn)染使兩株子宮內(nèi)膜癌細胞（Ishikawa，HEC-1A）PTEN表達水平改變。SB203580干預使 PTEN缺失 Ishikawa及HEC-1A細胞生長顯著抑制，細胞發(fā)生早期凋亡;p38MAPK通路磷酸化水平和磷酸化4E-BP1蛋白表達均顯著下降;與PTEN表達兩種細胞比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結(jié)論 內(nèi)外源性PTEN 缺失使兩株子宮內(nèi)膜癌細胞中p38MAPK通路活化，對SB203580敏感性增加，其機制可能與PTEN缺失導致PTEN對p38MAPK信號通路負性調(diào)控功能喪失，引發(fā)p38MAPK信號通路下游底物4E-BP1激活導致p38MAPK通路活化有關(guān)。

子宮內(nèi)膜癌;PTEN;p38MAPK通路抑制劑;敏感性

R 342.3;R 349.2;R 977

PTEN作為一個抑癌基因，在細胞生長、凋亡中具有重要生物學功能。研究［1］顯示PTEN基因?qū)φ隙鄺l上下游信號通路有重要作用。許多前期研究［2］顯示，相關(guān)信號通路僅在PTEN缺失情況下對相關(guān)信號通路抑制劑敏感，而PTEN基因是目前人子宮內(nèi)膜癌中突變率最高的基因。因此，該研究主要探討MAPK家族中p38MAPK通路特異性抑制劑SB203580對不同PTEN表達人子宮內(nèi)膜癌細胞的作用，為選擇以相關(guān)信號通路為靶點的子宮內(nèi)膜癌治療人群提高臨床療效提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系及質(zhì)粒 人子宮內(nèi)膜癌細胞株Ishikawa及HEC-1A由華中科技大學附屬協(xié)和醫(yī)院王澤華教授惠贈;pcDNA3.1-GFP/PTEN質(zhì)粒載體由華中科技大學附屬同濟醫(yī)院張惠蘭教授惠贈，G418抗性;pSilence TM siRNA表達載體（3.12 H1 hygro版本）、表達非特異siRNA的pSilenceTM siRNA表達載體購自英國Ambion公司，試驗中作為陰性對照，亦表達G418抗性基因。

1.1.2 主要試劑 PTEN單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司;p38MAPK、phospho-p38MAPK、4EBP1及phospho-4E-BP1購自美國CST公司;Annexin V-FITC試劑盒購自北京寶賽生物技術(shù)公司;p38MAPK抑制劑SB203580購自美國Biomol公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) Ishikawa和 HEC-1A細胞于含10%小牛血清DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。細胞在含5%CO2、飽和濕度及37℃條件下進行培養(yǎng)。

1.2.2 PTEN表達真核質(zhì)粒和小分子干擾真核載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 ①小分子干擾真核載體轉(zhuǎn)染:無血清培養(yǎng)基洗滌2次，HEC-1A細胞90%融合時行轉(zhuǎn)染pSilencerTM 3.1-siPTEN，具體轉(zhuǎn)染步驟按 Lipofectamine 2000試劑說明書上操作，置細胞培養(yǎng)箱中4～6 h更換完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24 h細胞置400 μg/ml G418培養(yǎng)液中培養(yǎng)，約4周后篩選出抗G418的HEC-1A-siPTEN陽性克隆;②PTEN穩(wěn)定轉(zhuǎn)染:以每孔2.5×105個Ishikawa細胞濃度種板，細胞90%融合時轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/PTEN。具體轉(zhuǎn)染步驟按Lipofectamine 2000試劑說明書上操作，轉(zhuǎn)染24 h細胞置400 μg/ml G418培養(yǎng)液中培養(yǎng)，約4周后篩選出抗G418的Ishikawa-PTEN陽性克隆。

1.2.3 干預實驗分組 根據(jù)PTEN表達或缺失情況，干預實驗分組為 PTEN表達或敲除HEC-1A、HEC-1A+DMSO、HEC-1A+SB203580（SB）10 μmol/L;PTEN缺失或表達Ishikawa、Ishikawa+DMSO、Ishikawa+SB 10 μmol/L。

1.2.4 激光共聚焦顯微鏡檢測PTEN蛋白表達

收集 Ishikawa、HEC-1A、PTEN 表達 Ishikawa、PTEN缺失HEC-1A細胞，每孔2.5×104個細胞濃度種板，放入多聚賴氨酸處理過的蓋片，培養(yǎng)24 h后去培養(yǎng)液。預冷100%甲醇－20℃固定細胞5 min;0.2%Triton-PBS漂洗3次;0.5%Triton-PBS破膜5～10 min。0.2%Triton-PBS漂洗3次，5%BSA 封閉1 h，單克隆PTEN抗體（1∶250）4℃孵育過夜;0.2%Triton-PBS漂洗3次×10 min/次;羊抗鼠IgGFITC（1 ∶1 000）室溫孵育1 h（避光）;0.2%Triton-PBS漂洗3次×10 min/次，PI復染核15 min，封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察照相。細胞質(zhì)中FITC標記PTEN蛋白表達綠色熒光為表達陽性，DAPI染細胞核表達藍色熒光。

1.2.5 MTT法檢測細胞增殖 各組細胞以1×104/ml的濃度種至96孔板，每孔100 μl，每組設(shè)3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后每孔加入MTT（5 mg/ml）10 μl作用 2 h后棄上清，加入150 μl DMSO 作用振蕩10～30 min，在自動酶標平板閱讀儀上以570 nm波長讀取吸光度（A）值。計算細胞存活率=（各濃度組A值/空白組A值）×100%。

1.2.6 流式細胞術(shù)檢測各組子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡情況 消化各組細胞，1 000 r/min離心5 min去除培養(yǎng)基，PBS洗滌1次，棄上清液，收集細胞。100 μl PBS重懸細胞，分別加入Annexin V-FITC試劑5 μl，室溫中避光孵育30 min，流式細胞儀（FACS Calibur，Becton-Dickinson公司）檢測，Cell Quest軟件分析。實驗重復3次。

1.2.7 Western blot檢測細胞內(nèi) p38MAPK 及 phospho-p38MAPK、phospho-4E-BP1及4E-BP1蛋白表達提取細胞總蛋白并檢測蛋白濃度，取30 μg總蛋白，10%SDS-PAGE凝膠電泳，100 V，電泳至溴酚藍達分離膠，加大電壓至200 V，直至溴酚藍達凝膠的底部，半干電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉，1∶500稀釋p38MAPK及phospho-p38MAPK、phospho-4E-BP1及4E-BP1一抗，4℃孵育過夜，加入1∶5 000過氧化物酶標記羊抗兔二抗，37℃孵育2 h，洗滌，ECL 顯影。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)均以xˉ±s表示，采用t檢驗進行比較。

2 結(jié)果

2.1 各組子宮內(nèi)膜癌細胞中PTEN蛋白表達 激光共聚焦顯微鏡顯示 HEC-1A及Ishikawa細胞PTEN蛋白表達分別為陽性和陰性，其表達主要在細胞質(zhì)中。PTEN穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Ishikawa細胞內(nèi)表達PTEN蛋白，而經(jīng)siPTEN處理HEC-1A細胞PTEN表達受到抑制。見圖1。

2.2 Annexin V-FITC檢測不同PTEN表達各組細胞凋亡 PTEN缺失情況下，SB203580顯著誘導Ishikawa及HEC-1A細胞發(fā)生早期凋亡，細胞早期凋亡率分別達（37.76±0.84）%及（32.75±1.36）%;顯著高于SB203580誘導PTEN表達Ish-ikawa和HEC-1A細胞早期凋亡率（P＜0.01）;DMSO作用PTEN表達或缺失Ishikawa及HEC-1A細胞凋亡率無明顯改變（P＞0.01）。見表1和圖2、3。

表1 細胞早期凋亡率比較（%，±s）

表1 細胞早期凋亡率比較（%，±s）

*PTEN缺失與PTEN表達各組細胞比較

組別 PTEN表達 PTEN缺失 t值 P值*HEC-1A 1.21 ±0.65 1.61 ±0.42－1.545 0.161 HEC-1A+DMSO 1.78 ±0.66 2.22 ±0.63－1.607 0.147 HEC-1A+SB 3.32 ±1.08 32.75 ±1.36－63.177 0.000 Ishikawa 1.42 ±0.77 1.39 ±0.75 0.892 0.398 Ishikawa+DMSO 1.25 ±0.42 1.76 ±0.56－1.971 0.084 Ishikawa+SB 3.13 ±0.72 37.76 ±0.84－138.729 0.000

圖1 兩株子宮內(nèi)膜癌細胞轉(zhuǎn)染前后PTEN蛋白免疫熒光表達 ×400

2.3 不同PTEN表達各組細胞存活率 PTEN缺失HEC-1A及Ishikawa細胞經(jīng)SB203580作用48 h，細胞生長明顯受到抑制，兩株細胞存活率僅為（49±3.0）%和（46±2.6）%，與SB203580作用PTEN表達HEC-1A及Ishikawa細胞比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）;DMSO作用PTEN表達或缺失Ishikawa及HEC-1A細胞存活率無明顯改變（P＞0.01）。見表2。

2.4 不同 PTEN表達各組細胞 p38MAPK及phospho-p38MAPK、4E-BP1及 phospho-4E-BP1蛋白表達 SB203580干預后，PTEN缺失HEC-1A及Ishikawa細胞phospho-p38MAPK表達下降，兩株細胞分別為（28.2±1.5）%和（24.1±1.7）%，與PTEN表達HEC-1A及Ishikawa細胞比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。對磷酸化4E-BP1蛋白Western blot條帶灰度值分析發(fā)現(xiàn):PTEN缺失HEC-1A和Ishikawa細胞phospho-4E-BP1蛋白Western blot條帶灰度值下降至（117 150±2 423）和（98 885±8 055），與 PTEN表達 HEC-1A及 Ishikawa細胞（370 120±1 903）和（410 051±1 009）比較，差異有統(tǒng)計學意義。SB203580干預前后，PTEN缺失或表達HEC-1A及Ishikawa細胞總4E-BP1蛋白無明顯改變。見圖4、5和表3。

表2 細胞存活率比較（%，±s）

表2 細胞存活率比較（%，±s）

*PTEN缺失與PTEN表達各組細胞比較

組別 PTEN表達 PTEN缺失 t值 P值*HEC-1A 96.0 ±1.7 97.0 ±2.4－0.209 0.840 HEC-1A+SB 90.0 ±1.3 49.0 ±3.0 8.200 0.000 HEC-1A+DMSO 95.8 ±1.0 94.1 ±2.2 0.423 0.121 Ishikawa 97.0 ± 2.5 96.0 ±2.1－0.207 0.841 Ishikawa+SB 89.0 ±1.8 46.0 ±2.6 9.383 0.000 Ishikawa+DMSO 96.0 ±1.2 95.6 ±0.9 0.701 0.192

圖2 Ishikawa細胞凋亡率比較

圖3 HEC-1A細胞凋亡率比較

圖4 SB203580干預前后不同PTEN表達兩株細胞phospho-p38MAPK蛋白表達比較

表3 SB203580干預前后不同PTEN表達兩株細胞phospho-p38MAPK蛋白表達率（%，±s）

表3 SB203580干預前后不同PTEN表達兩株細胞phospho-p38MAPK蛋白表達率（%，±s）

*PTEN缺失與PTEN表達各組細胞比較

組別 PTEN表達 PTEN缺失 t值 P值*HEC-1A 97.0 ±1.9 98.0±1.0－0.125 0.616 HEC-1A+SB 96.0+1.8 24.1 ±1.7 61.310 0.000 HEC-1A+DMSO 97.8 ±0.9 93.6 ±2.1 1.347 0.278 Ishikawa 98.0 ±1.1 97.5 ±1.4 0.183 0.092 Ishikawa+SB 96.4 ±2.3 28.2 ±1.5 46.500 0.000 Ishikawa+DMSO 95.8 ±1.2 96.0±0.6 0.571 0.147

3 討論

圖5 SB203580干預前后不同PTEN表達兩株細胞4E-BP1及phospho-4E-BP1蛋白表達

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道最為常見惡性腫瘤之一［3］，占女性生殖道惡性腫瘤的 20% ～30%，研究［4］顯示在其發(fā)生發(fā)展過程中抑癌基因失活、突變導致的信號通路異常激活可能發(fā)揮了重要作用。MAPKs信號通路是一類在腫瘤形成、進展和轉(zhuǎn)移中扮演著重要角色的蛋白激酶［5］，p38MAPK通路是MAPK家族重要成員，在多數(shù)腫瘤中都存在不正常激活或異常表達［6］，其主要通過細胞周期調(diào)控及誘導細胞凋亡發(fā)揮腫瘤抑制作用。

具有磷酸酶活性的腫瘤抑制基因PTEN在維持基因組穩(wěn)定性方面起著重要作用。PTEN缺失可能導致腫瘤細胞對相關(guān)化療、放療敏感性降低［7－8］。但亦有一些研究［9－10］顯示PTEN缺失或突變可導致腫瘤細胞對特異性信號通路抑制劑產(chǎn)生耐受。PTEN在人子宮內(nèi)膜癌中丟失率可高達60%～80%［11］，PTEN基因缺失突變與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系。目前有關(guān)子宮內(nèi)膜癌PTEN缺失與相關(guān)信號通路關(guān)系的研究還未見報道。

因此，本研究采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和小分子干擾RNA敲除改變Ishikawa和HEC-1A兩株子宮內(nèi)膜細胞PTEN表達，觀察p38MAPK通路抑制劑誘導不同PTEN表達人子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、凋亡等情況。結(jié)果顯示SB203580干預后，PTEN表達缺失子宮內(nèi)膜癌細胞生長明顯減緩，細胞發(fā)生顯著早期凋亡，而PTEN表達子宮內(nèi)膜癌細胞則無此趨勢，說明p38MAPK信號通路是調(diào)控PTEN表達缺失子宮內(nèi)膜癌細胞增殖的關(guān)鍵信號分子。蛋白定量結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌細胞中p38MAPK途徑異常激活與PTEN缺失相關(guān);p38MAPK特異性抑制劑SB203580可顯著下調(diào)PTEN表達缺失子宮內(nèi)膜癌細胞中p38MAPK通路及4E-BP1蛋白磷酸化水平。分析以上結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌細胞中 PTEN缺失使p38MAPK通路活化，其機制可能與PTEN缺失導致PTEN對p38MAPK信號通路負性調(diào)控功能喪失，引起PTEN下游靶基因4E-BP1轉(zhuǎn)錄改變有關(guān)。以上結(jié)果顯示PTEN表達缺失時，子宮內(nèi)膜癌細胞對p38MAPK信號通路抑制劑敏感性明顯增加，提示PTEN水平可成為預測相關(guān)信號通路抑制劑敏感與否的標志物之一。

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Effects of MAPK signal transduction inhibitors on endometrial carcinoma cells with different PTEN status and its mechanism

Xiao Lan，Long Tengfei，He Chan，et al
（Dept of Obstetrics and Gynecology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230022）

ObjectiveTo explore whether sensitivity to p38MAPK inhibitors are specifically due to status of PTEN in endometrial cancer Ishikawa and HEC-1A cells，and its related mechanisms.MethodsVector mediated PTEN-siRNA and PTEN gene were transfected into two endometrial cancer cells.The expression of PTEN protein was detected by confocal spectral microscopy.SB203580 treated for 48 hours，cell proliferation，cell early apoptosis，were studied by MTT method and flow cytometry（FCM），respectively.The activation of p38MAPK and 4E-BP1 was examined by Western blot.ResultsThe PTEN protein expression in two endometrial carcinoma cells（Ishikawa，HEC-1A）was exchanged by vector mediated PTEN siRNA and PTEN plasmid stable transfection.SB203580 could inhibit cell viability，induce cell early apoptosis of PTEN loss Ishikawa and HEC-1A cells after the cells exposed to SB203580.The expression of phosphorylation of p38MAPK and 4E-BP1 protein in PTEN loss Ishikawa and HEC-1A cells was significantly decreased.Compared with PTEN intact Ishikawa and HEC-1A cells the difference was significant（P＜0.01）.ConclusionLoss of PTEN results in the activation of p38MAPK signal pathway，and due to sensitive to p38MAPK signal transduction inhibitors in endometrial carcinoma cells.Those results suggest that cells with loss of PTEN have a feedback downregulation of receptor p38MAPK signalling pathway，which leads to PTEN inactivation of p38MAPK signaling pathway，the transcription change of the downstream gene targeted p38MAPK.

endometrial carcinoma;PTEN;p38MAPK signal transduction inhibitor;sensitivity

A

1000－1492（2014）05－0613－06

2014－02－17接收

廣東省自然科學基金（編號:7001568）

安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，合肥 230022

肖 蘭，女，博士，副研究員，主治醫(yī)師;

周家德，男，主任醫(yī)師，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail:zhoujiade@sina.com