DNMT3A和Hyp在ISO誘導(dǎo)大鼠心肌纖維化中的表達(dá)及相關(guān)性研究

汪裕琪，石開虎，吳君旭，徐盛松，陶 輝，宣海洋，曹 煒，沙紀(jì)名，占紅英

DNMT3A和Hyp在ISO誘導(dǎo)大鼠心肌纖維化中的表達(dá)及相關(guān)性研究

汪裕琪1，2，石開虎1，2，吳君旭1，2，徐盛松1，2，陶 輝1，2，宣海洋1，2，曹 煒1，2，沙紀(jì)名1，2，占紅英1，2

目的 探討DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A（DNMT3A）和羥脯氨酸（Hyp）在鹽酸異丙腎上腺素（ISO）誘導(dǎo)的大鼠心肌纖維化中的表達(dá)及相關(guān)性研究。方法 將40只雄性SD大鼠隨機(jī)等分為正常對(duì)照組和模型組。模型組給予ISO［5 mg/kg·d）］，正常對(duì)照組皮下注射給予等量生理鹽水，連續(xù)7 d后處死大鼠獲取血液標(biāo)本，并取心肌組織。同時(shí)，測(cè)定心重指數(shù)（HW/BW）、左心室質(zhì)量指數(shù)（LVW/BW）;采用ELISA法檢測(cè)血清中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的含量;HE染色和Masson染色法觀察心肌纖維化程度;Western blot法測(cè)定DNMT3A和α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的表達(dá);紫外分光光度法測(cè)定心肌組織中Hyp的含量。結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，模型組HW/BW、LVW/BW明顯增加;模型組血清標(biāo)本中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的含量較正常對(duì)照組明顯增加;HE染色和Masson染色顯示模型組心肌組織出現(xiàn)明顯的膠原纖維增生;Western blot法檢測(cè)顯示模型組DNMT3A和α-SMA的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.05，P＜0.01）;同時(shí)，紫外分光光度法檢測(cè)顯示模型組心肌組織中Hyp含量明顯增高（P＜0.05）;DNMT3A和Hyp在大鼠心肌纖維化組織中的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.675，P＜0.05）。結(jié)論 DNMT3A表達(dá)上調(diào)在心肌纖維化的形成過程中起重要促進(jìn)作用，可能與Hyp升高有一定的相關(guān)性。

心肌纖維化;DNMT3A;Hyp;膠原

心肌纖維化是指細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrixc，ECM）過度增生，主要表現(xiàn)為在心肌組織的間質(zhì)中膠原纖維過量積聚，膠原含量顯著升高或者各型的膠原比例失調(diào)等。心肌纖維化廣泛存在于多種心血管疾病中，與心律失常、心臟重構(gòu)、心功能衰竭以及心源性猝死等密切相關(guān)。特別是對(duì)于臨床上最常見的心律失常－心房顫動(dòng)，心肌纖維化的研究具有重要意義。心肌纖維化作為心房顫動(dòng)維持的重要基質(zhì)之一，對(duì)于心房顫動(dòng)的發(fā)展產(chǎn)生了重要影響［1］。但是心肌纖維化產(chǎn)生的確切機(jī)制以及相關(guān)通路尚不十分清楚。該課題通過對(duì)心房纖維化和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A（DNA methyltransferase 3A，DNMT3A）進(jìn)行相關(guān)性分析探討心房纖維化發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制，為心房顫動(dòng)的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，（180±20）g，6～8周齡，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 動(dòng)物分組及模型建立 40只大鼠隨機(jī)均分成兩組:正常對(duì)照組、模型組。模型組大鼠按5 mg/kg

體重背部皮下注射鹽酸異丙腎上腺素（isoprenaline，

ISO）（購自上海禾豐制藥有限公司），1次/d。正常對(duì)照組大鼠背部皮下注射與模型組等劑量的生理鹽水。

1.3 標(biāo)本采集及處理 兩組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)7 d后頸椎脫臼處死。腹主動(dòng)脈采血5 ml抗凝備用，沿心臟冠狀面最大橫徑剪開大鼠心臟，取心房組織置于

10%甲醛溶液中固定，經(jīng)石蠟包埋后，沿切面連續(xù)切片5張，每張厚4 μm，用HE染色和Masson染色觀察心房纖維化程度，并以膠原容積分?jǐn)?shù)（collagen volume fraction，CVF）作為心房纖維化指標(biāo)。剩余心肌組織裝入凍存管于液氮罐中保存。

1.4 心臟質(zhì)量參數(shù)的測(cè)定 末次給藥后禁食不禁飲24 h，大鼠稱體重（body weight，BW）后用10%水合氯醛（0.3 ml/kg）麻醉，腹主動(dòng)脈取血，取血清備用，開胸取出心臟，去除大血管、心外膜脂肪組織，用生理鹽水清洗，吸干后稱全心重（heart weight，HW）和左心室重量（left ventricle weight，LVW），計(jì)算心重指數(shù)（HW/BW）和左心室重指數(shù)（LVW/BW）。

1.5 HE染色、Masson染色及CVF計(jì)算 心肌組織切片烤熱后于二甲苯和梯度乙醇溶液中脫蠟至水。蘇木精染5 min，流水沖洗，1%鹽酸乙醇迅速分化，流水稍洗，促藍(lán)液返藍(lán)數(shù)秒，流水沖洗，依次行HE染色和Masson染色。光鏡下觀察、攝片。每張Masson染色切片選取3個(gè)無血管視野（×400），采用Image Pro Plus 6.0圖像掃描軟件進(jìn)行圖像分析，計(jì)算心肌CVF。CVF（%）=膠原面積/全視野面積×100%。

1.6 血清中Ⅰ型及Ⅲ型膠原含量的檢測(cè) 取血清，按照ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)說明，用酶標(biāo)儀測(cè)定血清中Ⅰ型和Ⅲ型膠原的含量。

1.7 心肌組織羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）含量的測(cè)定 取大鼠的左室心肌組織約200 mg，加入2 ml生理鹽水在冰浴環(huán)境中快速勻漿，3 500 r/min離心10 min，取上清液200 μl加生理鹽水800 μl，制成2%的組織勻漿，按Hyp試劑盒說明書操作測(cè)定Hyp含量，同時(shí)進(jìn)行蛋白測(cè)定。結(jié)果以每毫克蛋白中Hyp的含量表示。

1.8 Western blot法測(cè)定DNMT3A 和 α-平滑肌肌頭蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的表達(dá)

心肌總蛋白提取:取心肌組織塊1 g，加入總蛋白提取液1 ml，勻漿、裂解、離心，即得總蛋白提取液，測(cè)蛋白濃度，變性后－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩５鞍纂娪?采用8%分離膠及5%濃縮膠的SDS-PAGE系統(tǒng)。免疫印跡雜交:200 mA恒流電轉(zhuǎn)印 1 h。PVDF膜放入含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h，一抗工作液，4℃搖床過夜。洗膜，二抗工作液，37℃孵育1 h，洗膜。顯影:將A和B發(fā)光液按等體積混合，滴于 PVDF膜上，壓片，曝光，定影。采用 Lab Works4.5圖像獲取和分析系統(tǒng)軟件測(cè)定DNMT3A（102 ku）和α-SMA（42 ku）蛋白條帶的積分光密度（IOD）值，每個(gè)樣品均同時(shí)檢測(cè)GAPDH蛋白條帶的IOD值，以GAPDH作為內(nèi)參照，DNMT3A、α-SMA的相 對(duì) 表 達(dá) 量 以 IODDNMT3A/IODGAPDH、IODα-SMA/IODGAPDH值表示。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采取兩樣本t檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 ISO所致的心肌纖維化對(duì)大鼠心臟質(zhì)量參數(shù)的影響 與正常對(duì)照組比較，模型組HW/BW和LVW/BW明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 ISO所致的心肌纖維化大鼠血清中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的含量影響 模型組血清中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的含量明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。見表1。

表1 兩組HW/BW、LVW/BW以及血清中Ⅰ、Ⅲ型膠原含量的比較（n=20，±s）

表1 兩組HW/BW、LVW/BW以及血清中Ⅰ、Ⅲ型膠原含量的比較（n=20，±s）

與正常對(duì)照組比較:*P＜0.05

組別HW/BW（mg/g）LVW/BW（mg/g）Ⅰ型膠原（μg/L）Ⅲ型膠原（μg/L）正常對(duì)照 3.4 ±0.5* 2.0 ±0.6* 3.53 ±0.63* 1.84 ±0.78*模型5.2 ±0.6 3.1 ±0.4 5.81 ±0.96 4.23 ±0.52

2.3 HE染色、Masson染色及膠原容積分?jǐn)?shù) 計(jì)算經(jīng)Masson染色，心肌染紅色，細(xì)胞核染藍(lán)色，膠原纖維染綠色。見圖1。兩組CVF比較:正常對(duì)照組大鼠心肌組織膠原容積分?jǐn)?shù)明顯高于模型組（P＜0.05）。見表2。

圖1 大鼠心肌組織HE染色和Masson染色 ×400

2.4 ISO對(duì)大鼠心肌組織中Hyp含量的影響 與正常對(duì)照組比較，模型組Hyp含量顯著增加（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組大鼠心肌組織CVF及Hyp含量比較（n=20，±s）

表2 兩組大鼠心肌組織CVF及Hyp含量比較（n=20，±s）

與正常對(duì)照組比較:*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 CVF（%） Hyp（μg/g）正常對(duì)照5.80 ±1.62 365.23 ±98.34模型 11.32 ±2.50* 659.68 ±135.23＊＊

2.5 DNMT3A和α-SMA的表達(dá)情況 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌組織 DNMT3A、α-SMA含量均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。見圖2。

圖2 各組的DNMT3A和α-SMA的表達(dá)情況

2.6 相關(guān)性分析 結(jié)果顯示:DNMT3A蛋白水平與Hyp蛋白水平呈正相關(guān)（r=0.675，P＜0.01）。

3 討論

據(jù)文獻(xiàn)［2－4］報(bào)道，DNA 甲基化與肝纖維化和肺纖維化以及骨髓纖維化之間有著密切的關(guān)系，通過甲基化的過程來調(diào)控纖維化的發(fā)生以及發(fā)展，而器官纖維化的主要過程就是ECM以及膠原的增生，心肌纖維化亦不除外［5］。因此，該研究旨在探尋心肌纖維化與DNA甲基化之間是否存在內(nèi)在聯(lián)系。

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分，同組蛋白修飾相互作用，通過改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，調(diào)控基因表達(dá)［6－7］。在哺乳類細(xì)胞或人體細(xì)胞中，DNA 甲基化與細(xì)胞的增殖、衰老、癌變等生命現(xiàn)象有著密切關(guān)系［8］。催化DNA甲基化的DNMT的研究可以揭示DNA甲基化對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制，從而研究與之相關(guān)的重要生命活動(dòng)。哺乳動(dòng)物的DNMT有3種，主要分為2個(gè)家族:DNMT1和DNMT3（另有一種DNMT2，主要為tRNA的甲基轉(zhuǎn)移酶），DNMT1家族在DNA復(fù)制和修復(fù)中維持其甲基化;而DNMT3家族則催化CpG從頭甲基化。DNMT3包括了2個(gè)從頭甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A、DNMT3B和1個(gè)調(diào)節(jié)蛋白 DNMT3L［9－10］。α-SMA 是心肌成纖維細(xì)胞的活化標(biāo)志，心肌成纖維細(xì)胞是具有活躍的增殖和分泌膠原的能力，是ECM沉積增多的主要來源，進(jìn)而導(dǎo)致心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展。因此，α-SMA指標(biāo)是判斷心肌纖維化嚴(yán)重程度的代表性指標(biāo)。

動(dòng)物模型的穩(wěn)定性、高仿性和易操作性是心血管疾病動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的首要考慮因素。該研究采用皮下注射ISO是心肌纖維化模型方法中較為成熟的一種，具有可操作性強(qiáng)、時(shí)間短、見效快、性價(jià)比高的特點(diǎn)。

該研究表明皮下注射ISO制作心肌纖維化的動(dòng)物模型是可行的，且成功率較高。模型組血清中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的含量以及心肌組織中Hyp含量均明顯高于正常對(duì)照組，通過分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，對(duì)心肌組織中的DNMT3A以及α-SMA含量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)模型組心肌組織中的DNMT3A的表達(dá)量明顯增高，說明心肌纖維化的發(fā)生與發(fā)展可能與DNA甲基化有關(guān)，Hyp蛋白是反映心肌發(fā)生纖維化嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)之一，且DNMT3A和Hyp在大鼠心肌纖維化組織中的表達(dá)呈正相關(guān)。故通過研究DNMT3A與Hyp蛋白表達(dá)的相互關(guān)系，進(jìn)而初步探究DNMT3A在心肌纖維化中的作用，心肌纖維化的發(fā)生與發(fā)展可能與DNA甲基化有關(guān)，這為研究心肌纖維化的發(fā)生和發(fā)展提供了另一個(gè)思路，但同時(shí)對(duì)于DNMT3A究竟在心肌纖維化中起何種作用，尚不明確，有待于進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明心肌組織中DNMT3A含量升高可能參與心肌纖維化的形成，其機(jī)制可能是通過影響基因甲基化水平，進(jìn)而影響基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展，以期為心肌纖維化的預(yù)防以及治療藥物的研發(fā)提供新思路。

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Expression and correlation of DNMT3A and Hyp of isoprenaline induced myocardial fibrosis in rats

Wang Yuqi1，2，Shi Kaihu1，2，Wu Junxu1，2，et al
（1Dept of Cardiothoracic Surgery，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230601;2Cardiovascular Disease Research Center of Anhui Medical University，Hefei230032）

ObjectiveTo investigate the expression and correlation of DNA methyltransferase 3A（DNMT3A）and Hyp of isoprenaline（ISO）induced myocardial fibrosis in rats.Methods40 male SD rats were randomly divided into normal control group and model group.The model group was treated subcutaneously with 5 mg/（kg·d）isoprenaline daily for 7 days，but the normal control group was given the same amount of normal saline at the same time.Rats were executed to obtain blood samples and myocardial tissue.And HW/BW，LVW/BW were tested.ELISA was used to detect the content of typeⅠ collagen and typeⅢ collagen in serum.The degree of myocardial fibrosis was observed with HE staining and Masson staining method.The expression of DNMT3A and α-SMA was tested by Western blot.The content of hydroxproline in myocardial tissue was measured by UV spectrophotometry.ResultsHW/BW and LVW/BW increased significantly in the model group compared with the normal control group.The content of typeⅠ collagen and typeⅢ collagen in serum increased significantly in the model group compared with the normal control group.HE and Masson staining showed myocardial tissue in model group appeared obviously collagen fiber hyperplasia.The expression of DNMT3A and α-SMA in the model group was higher than the normal control group.UV spectrophotometric detection showed the content of Hyp in myocardial tissue in the model group increased obviously.The expression of DNMT3A and α-SMA in myocardial fibrosis tissue was positively correlated（r=0.675，P＜0.05）.ConclusionDNMT3A upregulation plays an important role in the myocardial fibrosis，and Hyp may increase a certain correlation.

myocardial fibrosis;DNMT3A;Hyp;collagen

R 542.23

A

1000－1492（2014）05－0606－04

2013－12－12接收

安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào):1308085MH117）;安徽省高等學(xué)樣省級(jí)自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào):KJ2011A175）

1安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院心胸外科，合肥 230601

2安徽醫(yī)科大學(xué)心血管病研究中心，合肥 230032

汪裕琪，男，碩士研究生;

石開虎，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail:shikaihu@gmail.com