Detection of Living Gastric Cancer Cell Response to Allicin Stimulation Based on Surface Plasmon Resonance Interferometric Imaging Sensing*

DOU Fuyin，WANG Peng*，XING Rui，DENG Shijie，LV Youyong，YU Xinglong

(1.State Key Laboratory of Precision Measurement Technology and Instruments，Department of Precision Instruments，

Tsinghua University，Beijing 100084，China;

2 Laboratory of Molecular Oncology，Key Laboratory of Carcinogenesis and Translational Research(Ministry of Education)，Peking University School of Oncology，Beijing Cancer Hospital and Institute，Beijing 100142，China)

Detection of Living Gastric Cancer Cell Response to Allicin Stimulation Based on Surface Plasmon Resonance Interferometric Imaging Sensing*

DOU Fuyin1，WANG Peng1*，XING Rui2，DENG Shijie1，LV Youyong2，YU Xinglong1

(1.State Key Laboratory of Precision Measurement Technology and Instruments，Department of Precision Instruments，

Tsinghua University，Beijing 100084，China;

2 Laboratory of Molecular Oncology，Key Laboratory of Carcinogenesis and Translational Research(Ministry of Education)，Peking University School of Oncology，Beijing Cancer Hospital and Institute，Beijing 100142，China)

Aimed at the requirement of living-cell detection，the method of SPR interferometric imaging sensing cell response was proposed.A novel microfluidic chamber was designed，and the system used for molecular detection on living-cell level was set up.The cell cultured state in chamber was detected and analyzed，and then the response of gastric cancer cell line BGC823 simulated by allicin was monitored.The results show that gastric cancer cells adhere and grow well，and the microfluidic chamber could maintain cell survival microenvironment.The SPR signal of cells stimulated and not stimulated by allicin was respectively 0.15 RIRF and 0.35 RIRF，which indicated that allicin has obvious inhibitory effect on the cells.It suggests the possibility of the establishment of a detection drug-stimulating-cells platform and contribution to the drug development and clinical chemotherapy after the precision，reliability，relative technology are further enhanced.

SPR interferometric imaging，microfluidic chamber，living-cell detection，allicin，gastric cancer cell line BGC823

大蒜素是在大蒜中提取的主要生物活性的物質［1－2］。已有研究表明，大蒜素可通過誘導細胞凋亡，抑制胃癌細胞系的增殖［3－4］。大蒜素對不同細胞系，甚至是個體的有效作用濃度都存在很大差異，因而精確檢測不同濃度大蒜素對細胞的作用極為必要。可是，現有的主要研究方法是基于MTT法，利用IC50計算化合物的作用濃度［5－6］，誤差較大，也無法直觀地觀測細胞對藥物的反應。藥物對癌細胞的作用復雜，同時還是一個動力學過程，迫切需要一種新穎的傳感和檢測方法。

表面等離子體共振SPR(Surface Plasmon Resonance)傳感器屬光學方法，既靈敏、實時和無需標記，又可同時獲得特異性、親和力以及動力學常數，已在生物分子相互作用檢測中發揮了尚無可替代的作用［7－10］。藥物對細胞的刺激，其本質是在細胞水平上發生分子相互作用后，繼而引起細胞的形態及內部生化反應變化。Katsutoshi Yoshizato等人基于SPR角度法，進行了細胞檢測的相關研究，實時分析配體誘導細胞表面和內部反應變化［11］，檢測了毒素(Toxin)B對RBL-2H3細胞的刺激作用［12］。角度法的不足是光束為線狀，難以覆蓋整個細胞，無法傳感整個細胞的響應。SPR成像法卻能實現群體、多個乃至單個細胞的傳感，因而很有潛力［13］。需要指出，目前只能獲取多個或群體細胞的傳感信號，還難以達到單細胞。

SPR成像傳感可分為光強法和相位法，后者的靈敏度高于前者［14］。光強法較簡單，首先被用于檢測細胞受刺激后的響應［15］。分子－細胞與分子－分子的相互作用比較，在同一傳感面上，因為細胞表面的可結合位點不多，作用開始時所獲得的傳感信號弱。因此，SPR傳感細胞首先面臨的是提高靈敏度。還有，分子對細胞刺激響應的檢測需要長時間，最好能達到一個細胞生長周期，長時間保持細胞的活性和持續實時傳感也是所面臨的。

針對上述細胞響應傳感的要求，基于本課題組完成國家基金“科學儀器專項”的研究成果——SPR雙分差動干涉成像檢測生物分子相互作用，提出了SPR雙分差動干涉(簡稱SPR干涉)成像傳感細胞法，設計專用于細胞檢測的微流體池，構建適于檢測細胞響應的相位傳感系統，進行大蒜素刺激胃癌細胞的檢測。實驗結果表明，不僅實現了靈敏檢測大蒜素刺激胃癌細胞的響應，而且獲得量化的SPR信號響應值。

1 實驗平臺

1.1 SPR干涉成像傳感系統

SPR干涉成像傳感細胞法的內涵是將從載有細胞的傳感芯片反射的光分成2束且同時產生偏振干涉，成為2束光強互補的干涉光，同時成像在2片CCD上，采集圖像解算得到傳感面折射率變化。實現該方法的傳感系統結構如圖1所示［16－17］，其基本工作原理:波長為635 nm激光由4 μm單模光纖輸出，經準直器準直、偏振片調制和擴束鏡擴束后射入Kretschmann棱鏡，激發SPR。反射光經1/2波片、遠心透鏡、成像透鏡和偏振分束棱鏡后，將傳感表面干涉成像在2片CCD上，可同時采集到相位差為π的2幀圖像。干涉圖像所對應的光強可用式(1)和式(2)分別表示

式中，E為入射光的振幅;θ為偏振方向與入射面夾角;φs、φp和rs、rp分別為S和P偏振分量的反射系數和相位變化。

為了便于分析，定義折射率相關因子RIRF(Refractive Index Related Factor)，它與同時獲得2幀相干圖像的關系為

由上式可知，一是RIRF與光強無關，避免了光強波動的影響;二是測量時θ固定，RIRF只與φs、φp和rs、rp有關，而發生SPR時rs和φs基本不變。只要Au膜表面的傳感層折射率RI(Refractive Index)變化，rp和φp隨即變化，RIRF完全與折射率變化一一對應。顯然，所得到的即時傳感表面的RIRF分布，不僅能真實地反映傳感表面的折射率變化，而且光強波動對其無影響，精度可更高。

當藥物分子經過細胞表面時，若其與細胞表面的有關受體特異結合，則導致傳感表面折射率變化，該系統就能傳感。不僅如此，藥物分子結合后持續地刺激細胞，不斷引起細胞內部生化反以及形態的變化，也能實時傳感，從而非常有利于分析藥物的作用。

圖1SPR雙分差動干涉成像傳感系統的示意圖

1.2 微流體池

微流體池必須既保證細胞生長的微環境，又能滿足SPR成像檢測的要求，不同于通道式檢測的結構，如圖2所示。從圖2可見，它包含4個培養腔，用PDMS(poly-dimethylsiloxane)澆注而成，每個腔的容積為200 μL，細胞在此培養。1只熱敏電阻被澆注在細胞培養室中，作為溫度傳感元件。Kretschmann棱鏡位于細胞培養室之下，其上表面依次鍍有2 nm Cr和40 nm Au;棱鏡的下表面貼有TEC(半導體加熱/制冷片)，作為加熱/制冷器件。

圖2 微流體池結構示意圖

用1塊硬鋁底板、2塊PMMA(有機玻璃)側板和1塊PMMA頂板，將所述的三部分固定為一體。PMMA進樣板固定在PMMA頂板上，使得每個細胞培養腔都具有獨立的進樣和出樣通道，各自形成一個密閉的培養環境，防止污染。PID閉環控制系統由熱敏電阻、TEC和控制電路組成，保證細胞生存在類似于生物體的恒溫下。PID控制算法采用分段控制和變速積分算法，如式(4)所示

其中，U(KT)是PID控制輸出即輸出電流值，N為常量，e為偏差值，T是采樣間隔時間，KP、Ki和Kd為PID系數，α1和α2為變速積分系數。在此，選擇N= 1.2 A、T=0.5 s、e0=2℃、e1=0.5℃、α1=1、α2=0.4。KP、Ki和Kd通過多次實驗調整后確定。當KP、Ki和Kd分別設為2、0.02和130時，實測結果:流體池恒溫在37℃，波動為±0.1℃，既適宜胃癌細胞的生長，又能滿足SPR檢測精度達到10－5RIU的要求。

2 實驗

2.1 細胞和試劑

BGC823細胞取自北京市腫瘤防治研究所。非CO2型細胞培養液購自Gibco，胎牛血清購自HyClone，11-Mercaptoundecanoic acid(MUA)、N-Hydroxysuccinimide(NHS)、N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride(EDC)和Poly-l-lysine(PLL)購自Sigma-Aldrich。

2.2 Au膜功能化化學修飾

必須將Au膜表面功能化修飾后，細胞才能在其上貼附生長。首先，將1 mmol/L MUA的酒精溶液滴在金膜表面，浸泡24 h，形成自組裝膜。接著，用酒精和去離子水洗凈并吹干，又將100 mg/mL的NHS水溶液和50 mg/mL的EDC水溶液按1∶1混合后，滴在金膜表面，浸泡30 min，活化自組裝膜。最后，用去離子水清洗并吹干，再將35 μg/mL PLL水溶液滴在活化的自組裝膜上，浸泡4 h，包裹一層PLL，保證細胞的貼附生長。

2.3 細胞培養狀態監測

微流體池的4個細胞培養腔分成2組，其中實驗組有3個，對照組只有1個。

將微流體池安置SPR雙分差動干涉成像傳感系統中。待溫度恒定后，實驗組的2個培養腔中注入高濃度細胞懸浮液(4×105/mL)，還有一個培養腔中注入低濃度細胞懸浮液(2×105/mL)，對照組中只注入純細胞培養液。培養5h，整個過程由成像傳感系統實時監測。培養完成后，用顯微鏡觀察細胞的生長狀態。

2.4 大蒜素刺激胃癌細胞的檢測

細胞培養與前述相同。首先，將細胞密度為4 ×105/mL的懸浮液接種到微流體池的4個培養腔中，培養3 h，使細胞在芯片表面貼壁。然后，其中2個培養腔內的培養液被置換成含有30 μg/mL大蒜素的細胞培養液，作為實驗組，另外2個培養腔中的培養液被置換成純細胞培養液，作為對照組。培養6 h，整個過程由成像系統實時檢測。檢測完成后，再用顯微鏡觀察2組細胞的狀態。

2.5 實驗數據分析

圖3 同時采集的相位差為π的2幀干涉圖像

在細胞培養或大蒜素刺激過程中，成像傳感系統同時采集相位差為π的2幀干涉圖像，如圖3所示。根據式(3)，計算機實時處理，便得到即時傳感芯片表面對應的RIRF分布圖，如圖4所示。整個過程持續進行，便可得到一系列RIRF分布圖。由圖4可見，共有4個區域的RIRF分布，每個區域反映所對應培養腔內的細胞狀態。同時還可見，為了方便數據處理，在每一區域中選取4個小部分，圖中所示為矩形框，該區域的SPR信號值為這4小部分RIRF的平均值。由所得到的RIRF分布圖，就可實時計算出RIRF隨著時間變化SPR的信號曲線，反映出細胞的培養狀態或對大蒜素的刺激響應。

圖4 某一時刻芯片表面RIRF分布

3 結果和討論

3.1RIRF和折射率的對應關系

活細胞的折射率約為1.36左右，高于通常的生物分子溶液(1.333左右)，因此系統的檢測范圍應更高。不同的甘油溶液對應著不同的折射率，由此可獲得不同折射率的甘油溶液，用以標定RIRF與折射率的關系曲線。設光的入射角為62°，分別測試折射率為1.352～1.369的甘油溶液所對應的RIRF，結果如圖5所示。由圖可見，當折射率在1.352～1.369變化時，RIRF與折射率為線性關系，且120 RIRF/ 1 RIU。因此，該系統能滿足活細胞檢測要求。

圖5RIRF和RI的對應關系

3.2 細胞培養狀態

細胞培養狀態的檢測結果如圖6所示，由圖6可得出:

(1)對照組的信號曲線接近水平，表明該系統的基線漂移小，有利于高精度檢測。

(2)2條高濃度細胞懸浮液的SPR信號曲線趨勢一致，表明系統重復性較好，也為后續的陣列檢測奠定了基礎。可是，略有差異，可能是在接種細胞時2個腔內接種的細胞數量未能保證嚴格相等所致。

(3)實驗組的每條SPR信號曲線都是先斜率大，而后越來越小。對應實驗過程分析，當細胞懸浮液剛接種到微流體池中時，細胞受重力作用，細胞會快速沉淀到芯片表面，此時芯片表面質量快速增加，SPR信號變化最大。其后，細胞在芯片表面貼附伸展，表面質量變化變緩，對應SPR信號變化越來越小。在細胞接種2 h后，BGC823細胞已基本在芯片表面完全貼附，SPR信號隨之變化很小。由此可見，SPR能夠動態監測細胞的貼附生長過程。

(4)由前述分析還可得出，高低濃度細胞懸浮液的最終SPR信號響應值分別約為0.87 RIRF和0.40 RIRF，SPR信號的最終響應值正比于細胞接種濃度。

圖6細胞培養狀態檢測SPR信號

圖7 所示為2組細胞的顯微照片。由圖可見，濃度高組的細胞數量明顯多于低濃度組，即高濃度組芯片表面質量變化更大，這與圖6中所示的SPR信號曲線一致。從圖中還可見，細胞貼壁生長狀態良好，展現正常的生理機能，表明該微流體池能滿足細胞生存的生理條件要求，保證檢測的可靠進行。

圖72 組細胞的顯微照片

3.3 大蒜素刺激細胞響應

大蒜素對胃癌細胞系BGC823刺激響應的檢測結果如圖8所示。曲線1和曲線2分別是2個實驗組培養腔內細胞被大蒜素刺激后的RIRF曲線，曲線3和曲線4分別是2個對照組培養腔內細胞的RIRF曲線。從圖8可看出，曲線1和2明顯低于曲線3和4，表明大蒜素可抑制BGC823細胞的增殖。可是，曲線1和2沒有重疊，導致的原因可能如同4.2所述。從圖8還可得出，實驗組和對照組的最終響應值分別為0.15 RIRF和0.35 RIRF。

圖8 大蒜素對胃癌BGC－823細胞刺激響應信號

圖9所示為2組細胞的顯微圖片。從圖中可見，刺激組的細胞形態不同于對照組，折光性變強，出現了明顯的凋亡細胞的形態。實驗組的細胞受到大蒜素刺激后，其增殖能力低于對照組細胞，且形態發生變化，引起RIRF信號變小。

圖92 組胃癌BGC－823細胞的顯微照片

4 結論

綜合上述實驗結果與分析，可得出如下結論:

(1)所構建的SPR干涉成像傳感細胞響應系統能真實地反映傳感表面的折射率變化，且光強波動對其無影響，有利于進行高精度細胞檢測。

(2)所設計的微流體池的恒溫在(37±0.1)℃，胃癌細胞在其中貼附生長良好，且能滿足SPR檢測精度對溫度的要求，適用于藥物刺激細胞檢測。

(3)在大蒜素刺激的6 h內，實驗組和對照組的最終響應值分別為0.15 RIRF和0.35 RIRF，差異具有統計學意義，表明大蒜素對胃癌細胞系BGC823的增殖具有抑制作用。

在活細胞水平上檢測藥物刺激響應具有挑戰性。研究還是初步的，我們將不斷完善檢測系統，持續提高精度和可靠性，豐富有關工藝技術，拓寬檢測領域，力爭建立完整的藥物刺激細胞響應檢測技術平臺，為藥物發現和臨床化療方案優化做出貢獻。

［1］Miron T，Rabinkov A，Mirelman D，et al.The Mmode of Action of Allicin:Its Ready Permeability through Phospholipid Membranes May Contribute to Its Biological Activity［J］.Biochemical et Biophysica Acta，2000，1463:20－30.

［2］Hiroyuki F，Kaoru S，Kama O，et al.Biological and Cchemical Stability of Garlic-Derived Allicin［J］.J Agric Food Chem，2008，56: 4229－4235.

［3］Suby O，Ruby J A，Gopal S，et al.Allicin(from Garlic)Induces Caspase-Mediated Apoptosis in Cancer Cells［J］.European Journal of Pharmacology，2004，485:97－103.

［4］Xiao D H，Tpinto J，Soh J W，et al.Induction of Apoptosis by the Garlic-Derived Compound S-Allymercaptocysteine(SAMC)is Associated with Microtubule Depolymerization and c-Jun NH2-Terminal Kinas 1 Activation［J］.Cancer Research，2003，63:6825－6837.

［5］Suarez M F，Ting A Y.Fluorescent Pprobes for Super-Resolution Imaging in Living Cells［J］.Molecular Cell Biology，2008(9):929－943.

［6］Velasco-Garcia M N.Optical-Biosensor for Probing at the Cellular Level:A Review of Recent Progress and Future Prospects［J］.Seminars in Cell and Development Biology，2009，20:27－33.

［7］Karlsson R.SPR for Mmolecular Interaction Analysis:A Review of Emerging Application Areas［J］.Journal of Molecular Recognition，2004，17:151－161.

［8］Robelek R.Surface Pplasmon Resonance Sensors in Cell Biology: Basic and Application［J］.Bioanal Rev，2009(1):57－72.

［9］劉儒平，王程，徐萬幫，等.基于生物素－親和素放大的SPR傳感器檢測大腸桿菌研究［J］.傳感技術學報，2013，26(6):757－761.

［10］謝永紅，王耀玲，程小麗，等.SPR生物傳感器在急性白血病髓系抗原CD33檢測中的應用［J］.傳感技術學報，2011，24(1): 1－4.

［11］Michihiro H，Tomoko T，Hajime S，et al.Real-Time Analysis of Ligand-Induced Cell Surface and Intracellular Reaction of Living Mast Cells Using a Surface Plasmon Resonance-Based Biosensor［J］.Analytical Biochemistry，2002，302:28－37.

［12］Yuhki Y，Hidenori S，Tomoko T，et al.The SPR Signal in Living Cells Reflects Changes other than the Area of Adhesion and the Formation of Cell Constructions［J］.Biosensors and Bioelectronics，2007，22:081－1086.

［13］Chen K X，Obinata H，Takashi I.Detection of G Protein-Coupled Receptor-Mediated Cellular Response Involved in Cytoskeletal Rearrangement Using Surface Plasmon Resonance［J］.Biosensors and Bioelectronics，2010，25:1675－1680.

［14］王大千.SPR雙分差動干涉成像陣列檢測生物分子相互作用技術［D］.北京:清華大學精密儀器系，2012.

［15］Alexander W P，Halter M，Alessandro T，et al.Using Surface Plasmon Resonance Imaging to Probe Dynamic Interactions between Cells and Extracellular Matrix［J］.Cytometry Part A，2010，77A: 895－903.

［16］余興龍，王大千，張瑋，等.SPR雙分差動干涉成像生物分子相

互作用分析儀［J］.清華大學學報，2013，53(2):160－166.

［17］張瑋，鄧焱，王大千，等.制冷雙CCD采集系統在SPR=成像中的應用［J］.儀器儀表學報，2011，32(8):1751－1756.

竇福印(1985－)，男，漢族，清華大學精密儀器系博士研究生，主要研究方向為SPR生化傳感器，fuyindou@163.com;

王鵬(1977－)，男，漢族，清華大學精密儀器系副教授，博士，主要研究方向為傳感器材料、傳感器和智能儀器，peng@mail.tsinghua.edu.cn;

余興龍(1948－)，男，漢族，清華大學精密儀器系教授，博士生導師，1970年畢業于清華大學精儀系，研究重點為分子相互作用檢測、細胞檢測，jyxyxl@ mail.tsinghua.edu.cn。

基于SPR干涉成像傳感法檢測大蒜素刺激胃癌細胞的響應*

竇福印1，王鵬1*，邢蕊2，鄧士杰1，呂有勇2，余興龍1
(1.清華大學精密儀器系精密測試技術及儀器國家重點實驗室，北京100084; 2.北京大學腫瘤醫院/北京市腫瘤防治研究所惡性腫瘤發病機理及轉化研究教育部重點實驗室分子腫瘤學實驗室，北京100142)

針對細胞響應傳感的要求，提出了SPR干涉成像傳感細胞響應的方法，設計制作新穎的微流體池，構建用于活細胞水平分子傳感和檢測的系統。在此基礎上，先檢測和分析細胞在微流體池中的培養狀態，再檢測大蒜素對人胃癌細胞系BGC823刺激響應。實驗結果表明，胃癌細胞貼附生長良好，微流體池可提供細胞生存的微環境;6 h后大蒜素刺激和對照的SPR信號響應值分別為0.15 RIRF和0.35 RIRF，大蒜素對胃癌細胞系BGC823細胞具有明顯抑制作用。在持續提高精度、可靠性以及豐富有關工藝技術后，有可能建立完整的藥物刺激細胞響應檢測技術平臺，為藥物發現和臨床化療方案優化做出貢獻。

SPR干涉成像;微流體池;活細胞檢測;大蒜素;胃癌細胞系BGC823

R197.39

A

1004－1699(2014)04－0432－06

2013－11－18修改日期:2014－03－24

C:7230J

10.3969/j.issn.1004－1699.2014.04.003

項目來源:國家自然科學基金項目(30970757，30727001)