肝細胞生長因子對人胃癌細胞株AGS增殖的促進作用

凌躍新 童賽雄

(復旦大學附屬中山醫院普外科，上海 200032)

肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)是一種多肽生長因子，具有促進肝細胞、上皮細胞、內皮細胞、造血細胞等多種細胞生長、遷移和形態改變的作用。HGF主要在間質細胞中表達，但在小腸、大腦、甲狀腺、胸腺和胎盤中也有表達[1]。近年發現，多種腫瘤組織中均可檢測到HGF的過度表達，說明HGF可能在腫瘤進展中有重要作用。本研究旨在探討HGF對人胃癌細胞株AGS增殖的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 人胃癌細胞株AGS購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所，CCK-8試劑盒購自日本同仁化工公司，人HGF試劑盒購自美國PeproTech公司，胎牛血清購自美國Corning公司，RPMI-1640培養液、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司，BioRAD酶標儀購自美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 采用RPMI-1640培養液(含10%胎牛血清， 100 U/mL青霉素， 100 μg/mL鏈霉素，0.056%NaHCO3，pH值7.4)，在37℃、CO2體積分數為5%的培養箱內培養AGS細胞，用0.25%胰酶消化傳代。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖 收集對數生長期的AGS細胞，用血球計數板計數后將細胞加入96孔板，5000個/孔，每組設3個復孔，分別用濃度為0、25、50、75和100 ng/mL的HGF處理，終體積200 μL。在37℃、5%CO2條件下培養24 h、48 h、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，培養箱內繼續孵育2 h后，每孔加入10 μL 0.1 mol/L的HCl溶液終止反應，用酶標儀檢測細胞在450 nm處的光密度D值。

2 結 果

采用終濃度分別為25、50、75和100 ng/mL的HGF處理AGS細胞，并在不同的時間點進行增殖試驗。CCK-8法檢測結果顯示，不同濃度的HGF對AGS細胞均有促增殖作用，且隨HGF濃度增加或作用時間的延長，細胞增殖活力呈上升趨勢,在72 h最為明顯。各濃度組HGF與陰性對照組之間差異均有統計學意義(t=3.89、5.28、9.73和11.00，P<0.01)。不同實驗組在同一時間段進行比較，在細胞培養72 h時，各HGF濃度下的細胞增殖活力均顯著高于24 h組(P<0.01)；在細胞培養48 h時，HGF濃度為25、50、75 ng/mL的組別的細胞增殖活力均極顯著高于24 h組(P<0.01)，僅HGF為 100 ng/mL的組別細胞增殖活力顯著高于24 h組(P<0.05)。這表明在一定濃度和時間范圍內，HGF對人胃癌細胞株AGS增殖的影響存在濃度依賴關系和時間依賴關系。見圖1。

與24 h組比較，**P<0.01, *P<0.05

3 討 論

HGF在80年代被發現，因其對肝細胞具有較強的絲裂原作用而被命名為肝細胞生長因子[2]。Stoker等[3]發現，成纖維細胞能分泌一種促進上皮細胞集落擴散的細胞因子，稱為離散因子(scatter factor,SF)。后來發現，HGF和SF為同一物質。HGF受體是原癌基因c-Met編碼的跨膜蛋白產物，具有酪氨酸激酶活性。HGF基因編碼含有728個氨基酸的蛋白質。成熟的HGF的相對分子量在非還原狀態下為90 kD，是由60 kD的α鏈和30 kD的β鏈經二硫鍵連接而成的異二聚體，由前體蛋白分解斷裂產生。HGF的α鏈是一個可形成發夾結構的N末端區，連接4個絞鏈區域，α鏈N末端的發夾樣結構、前2個絞鏈區結構和α鏈存在是HGF發揮生物學活性的必要條件。HGF的α鏈可以單獨與c-Met結合，但缺乏α鏈的HGF將喪失其生物學活性[4]。

HGF主要由腫瘤組織中的成纖維細胞分泌，亦可由腫瘤細胞分泌。有些腫瘤細胞可同時表達HGF和c-Met，腫瘤組織產生的HGF可通過自分泌和旁分泌途徑來促進腫瘤細胞的生長。腫瘤細胞的生長與腫瘤組織中HGF含量有關，血清 HGF值隨著腫瘤的進展而升高。HGF的過度表達常提示腫瘤的惡性程度高，且易轉移和復發[5]。HGF與腫瘤細胞上的c-Met結合后，可刺激細胞增殖，并參與腫瘤新生血管的生成。

本研究結果顯示，在25～100 ng/mL濃度范圍內，HGF可促進AGS細胞的增殖，隨著HGF濃度的增加或作用時間的延長，其促進細胞增殖的作用增強，呈時間、濃度依賴關系(P<0.01)，提示HGF對腫瘤的發生、發展具有重要作用。Lee等[6]研究發現，用HGF刺激人胃癌細胞后，可上調細胞中Jun B和基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達，使癌細胞在體外實驗中表現出較強的增殖和侵襲能力。Recio等[7]對鼠黑色素瘤細胞的研究發現，HGF通過增加cyclin D1蛋白的表達，可激活細胞內p38-ATF-2信號通路，最終影響細胞增殖。Zhang等[8]用HGF處理人平滑肌肉瘤細胞后發現，HGF通過激活c-Src激酶而激活細胞內Stat3信號通路，以此促進腫瘤細胞的增殖。

綜上所述， HGF在體外對人胃癌細胞株AGS的增殖有促進作用，且呈時間、濃度依賴性。

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[8]Zhang YW, Wang LM, Jove R, et al. Requirement of Stat3 signaling for HGF/SF-Met mediated tumorigenesis[J]. Oncogene, 2002, 21(2):217-226.