廣西近江牡蠣中性蛋白酶酶解工藝優化

宋忠魁，潘文秀，謝濤，葉開富，龍智翔，黃島平

（1.廣西分析測試研究中心，廣西南寧 530022；2.廣西海洋研究所，廣西北海 536000；3.欽州學院數學與計算機科學學院，廣西欽州 535099）

廣西近江牡蠣中性蛋白酶酶解工藝優化

宋忠魁1，2，潘文秀3，謝濤1，葉開富1，龍智翔1，黃島平1

（1.廣西分析測試研究中心，廣西南寧 530022；2.廣西海洋研究所，廣西北海 536000；3.欽州學院數學與計算機科學學院，廣西欽州 535099）

優化影響近江牡蠣中性蛋白酶酶解的幾個關鍵因素，包括溫度、pH、加酶量和時間。通過建立L16（44）正交表，并以水解度和鮮味氨基酸百分比為試驗指標開展優化實驗。其中以水解度為試驗指標時，工藝優水平是酶解溫度45℃、pH7.5、加酶量3 900 U/g、酶解時間5 h；以鮮味氨基酸百分比為試驗指標時，工藝優水平是酶解溫度40℃、pH7.5、加酶量3 900 U/g、酶解時間4 h。溫度是影響中性蛋白酶酶解工藝的首要因素。

關鍵詞：近江牡蠣；中性蛋白酶；鮮味氨基酸

應用生物酶法改變傳統蠔油生產工藝的相關研究由來已久，包括了酶種的篩選與評價、從單酶種酶解到多酶種的復合酶解、從單因素試驗到正交試驗方法的應用等[1-8]。研究獲得了一系列酶種水解牡蠣反應的優水平，如果從生產蠔油的目的出發，多數研究推薦使用中性蛋白酶，因為其工作的酸堿度環境與新鮮牡蠣肉的pH接近[1]，并且水解度適中、水解產物的風味好[2-4]。從已報道的中性蛋白酶酶解牡蠣的優水平來看，決定酶解反應的幾個要素是有波動的，不同的牡蠣種類、同一牡蠣種類但不同來源以及不同的試驗指標對之均有影響。

廣西沿海盛產近江牡蠣[9]，為酶法生產蠔油提供了大量的原材料。文章采用水解度和鮮味氨基酸百分比作為試驗指標，通過正交試驗探討枯草芽孢桿菌中性蛋白酶酶解近江牡蠣的工藝條件，基于極差分析和方差分析提出工藝優水平，為開展近江牡蠣酶法生產蠔油中試提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

近江牡蠣鮮品由廣西欽州市海華蠔業科技有限公司提供，去殼取牡蠣肉，直接使用Milli-Q水清洗，塑料網篩瀝水，組織搗碎、分裝、冷凍貯藏。

枯草芽孢桿菌中性蛋白酶（13萬U/g）購自南寧東恒華道生物科技有限責任公司。

1.2 儀器與設備

Milli－Q Academic A10 超純水機：美國 MILLIPORE公司；LB20ES高速組織搗碎機：美國WARING公司；HJ－3控溫磁力攪拌器：江蘇金壇醫療儀器廠；PHSJ－4A pH酸度計：上海精密科學儀器有限公司；SHHW21.600A三用恒溫水箱：上海洪紀儀器設備有限公司；簡易凱氏定氮裝置：南寧匯鑫化玻儀器有限公司；CL31R臺式多用離心機：美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

近江牡蠣去殼、洗凈、瀝干→稱重、搗碎→調pH、加酶→保溫酶解→酶滅活→離心→殘渣稱重。

1.3.2 總氨基氮質量測定

采用甲醛滴定法[10]測定水解液的總氨基氮質量。

1.3.3 總氮質量的測定

依據《食品中蛋白質的測定方法》（GB5009.5－85），采用凱氏定氮法測定水解液的總氮含量。

1.3.4 氨基酸質量的測定

委托廣西壯族自治區分析測試研究中心檢測（檢驗報告編號：LL1004060E；樣品編號：LL1004060E－379～394）。

1.4 計算公式

1.4.1 水解度計算

1.4.2 鮮味氨基酸質量百分比計算

[11－13]，規定這里的鮮味氨基酸包括天門冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸等。

1.5 工藝優化試驗設計

采用四因素、四水平的正交試驗設計進行工藝優化，因素、水平設置如表1所示。

表1 因素、水平排列表Table 1 Arrangements of the levels and the factors

2 結果與分析

2.1 近江牡蠣酶解的正交試驗

酶解試驗結果見表2。

其中k1～k4是ABCD 4個因素在4個水平的水解度之和，k1～k4是ABCD 4個因素在4個水平的鮮味氨基酸百分比之和；極差（R或R）是ABCD 4個因素在4個水平上最大的綜合平均值與最小的綜合平均值之差。從水解度的K值看，工藝優水平是A2B3C3D4；從鮮味氨基酸百分比之K值看，工藝優水平是A1B3C3D3。極差分析表明，以水解度為試驗指標，主次因素是A＞C＞D＞B；以鮮味氨基酸百分比為試驗指標，主次因素是A＞D＞C＞B。

表2 近江牡蠣酶解的正交試驗結果Table 2 Results from Orthogonal arrays of Ostrea rivularis enzymolysis

圖1 同種處理水解度和鮮味氨基酸百分比的對照Fig.1 Pairwise comparison between degree hydrolysis（DH）and the percentage of delicious amino acid under the same treatment

圖1能直觀地反映水解度、鮮味氨基酸百分比兩者之間的關系。結果顯示，兩者之間表現出的一致性比較差，即水解度高并不意味鮮味氨基酸百分比高。由此表明：近江牡蠣酶解試驗過程是復雜的，選擇不同的酶解試驗指標需要制定不同的優化方案。

2.2 單因素方差分析

利用PASW Statistics 18開展單因素方差分析，結果表明：以水解度為指標，4個因素均未表現出方差顯著性（P值均大于0.05，表3）；以鮮味氨基酸百分比為指標，4個因素的P值均大于0.05（表4）；同時，無論以水解度還是以鮮味氨基酸百分比為指標，單因素方差分析揭示的ABCD 4個因素的主次順序均是A＞D＞C＞B。由此看來，以水解度為試驗指標時，單因素方差分析與極差分析所產出的結果有出入；以鮮味氨基酸百分比為試驗指標時，單因素方差分析與極差分析的結果保持一致。

表3 水解度的單因素方差分析Table 3 One-way ANOVA（Analysis of Variance）of degree hydrolysis（DH）

表4 鮮味氨基酸百分比的單因素方差分析Table 4 One-way ANOVA based on the percentage of delicious amino acid（DAA）

假定方差齊性并執行LSD（L）測試以開展單個因素水平間兩兩比較，結果表明：以水解度為指標，因素A（溫度）的水平1和水平4、水平2和水平4之間的差異接近顯著性（P1，4=0.086，P2，4=0.071），其余水平之間未檢測到顯著性，BCD 3個因素的不同水平之間的比較均未檢測到顯著性；以鮮味氨基酸百分比為指標，僅在因素A（溫度）的水平1和水平3之間檢測到顯著性（P1，3=0.031）。

3結論

酶解工藝需要優化的因素通常包括pH、溫度、加酶量、時間和底物濃度，這里采用的是固定的料水比（1∶3），也就是一定的底物濃度；所以，選擇其余4個因素作為優化對象并利用L16（44）正交表優化之，結論如下：

1）選擇水解度為試驗指標時，工藝優水平是A2B3C3D4，即酶解溫度（45℃）、加酶量（3 900 U/g）、pH7.5、酶解時間（5h）；選擇鮮味氨基酸百分比為試驗指標時，工藝優水平是A1B3C3D3，即酶解溫度（40℃）、加酶量（3900U/g）、pH 值 7.5、酶解時間（4 h）；其中，加酶量（3 900 U/g）和pH（7.5）被一致選擇。

2）在4個因素中，溫度是影響中性酶酶解工藝的首要因素，而時間因素是相對次要的因素；極差分析和方差分析結果基本保持一致。至于因素的主次關系可能與因素的設置水平有關，譬如，熊輝巖和段瑞君的研究結果指出pH是影響中性酶酶解的首要因素[14]。

3）在同樣處理下，水解度和鮮味氨基酸百分比之間的關系是水解度高并不意味鮮味氨基酸百分比高。由此表明，同一酶種若采用不同試驗指標，工藝參數需要優化。此外，同一酶種因研究目標不同其工藝參數變化也很大，汪秋寬等[15]利用中性蛋白酶酶解牡蠣以制備抗氧化活性肽的最佳酶解工藝參數竟然是酶解時間110 min、酶用量3%、溫度 65℃、pH 6.0，與以生產蠔油為目標的參數比較有較大出入，尤其是溫度和pH。

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Hydrolysis Technology Optimization of Neutral Proteinase for Guangxi Ostrea Rivularis

SONG Zhong-kui1，2，PAN Wen-xiu3，XIE Tao1，YE Kai-fu1，LONG Zhi-xiang1，HUANG Dao-ping1
（1.Guangxi Zhuang Autonomous Region Center for Analysis&Test Research Nanning 530022，Guangxi，China；2.Guangxi Institute of Oceanology，Beihai 536000，Guangxi，China；3.College of Mathematics&Computer Science，Qinzhou University，Qinzhou 535000，Guangxi，China）

Abstract：To optimize the four key factors including temperature， pH value， protease volume， and time for neutral proteinase hydrolyzing fresh oyster，the L16（44）orthogonal list was first chosen in the test，and then hydrolysis degree and percentage of delicious amino acid as array criteria.The optimal technology parameters for the hydrolysis degree were temperature 45℃，pH value 7.5，protease volume 3 900 U/g，and hydrolysis time 5 h，while using the percentage of delicious amino acid，instead of temperature 40℃，pH value 7.5，protease volume 3 900 U/g，and hydrolysis time 4 h.The results showed that the temperature was corroborated as the most important factor of enzymatic technology of neutral proteinase.

Key words：Ostrea rivularis；neutral proteinase；delicious amino acid

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2014.06.016

廣西科學研究與技術開發計劃項目(桂科攻09321004)

宋忠魁（1973—），男（漢），副教授，博士，研究方向：水產、食品生物技術。

2013－12－29