體外培養人臍帶血間充質干細胞向胰島細胞分化及對糖尿病治療的實驗研究

王英 羅浩虹 高洪泉 繆智輝 趙亞清

·論著·

體外培養人臍帶血間充質干細胞向胰島細胞分化及對糖尿病治療的實驗研究

王英 羅浩虹 高洪泉 繆智輝 趙亞清

目的 研究人臍帶血間充質干細胞向胰島素分泌細胞分化的潛能及其移植后對糖尿病大鼠的治療效果。方法 體外分離培養HUCB-MSCs, 在胰島細胞培養條件下經藥物定向誘導其分化；免疫組化對誘導細胞進行胰島β細胞標記鑒定；雙硫腙染色鑒定鋅離子表達及檢測胰島樣細胞的移植效果。結果 HUCB-MSCs經誘導后, 免疫細胞化學染色顯示表達人胰島素；雙硫腙染色呈棕紅色；移植后2周, 胰島樣細胞組血糖濃度明顯降低。結論 HUCB-MSCs在體外誘導培養條件下, 具有向胰島素分泌細胞分化的潛能, 這種細胞可能為Ⅰ型糖尿病提供一條新的治療途徑。

人臍帶血；間充質干細胞；定向誘導；糖尿病

2000年, Erices等［1］報道人臍血中含有豐富的造血干細胞和間充質干細胞(mesenchymal stem cell/ mesenchymal progenitor cell, MSC/MPC)。臍帶血間充質干細胞(umbilical cord blood mesenchymal stem cells, UCB-MSCs)為中胚層發育的早期細胞, 具有多向分化的潛在能力, 其形態和生物學特點與骨髓來源 MSCs 相似［2］。UCB-MSCs具備自我更新和增殖的能力, 并具備多向分化潛能特性。在一定條件下進行體外培養和誘導分化后具有向神經細胞(神經元和神經膠質細胞)、成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞和心肌細胞等方向分化功能, 可作為細胞治療的種子細胞和基因治療的載體細胞［3-5］。臍血又具有淋巴細胞抗原性弱、功能相對不成熟、移植后發生移植物抗宿主病的風險較低等特點, 與其他類型的干細胞比較, 取材方便, 擴增數大, 來源廣泛, 不受倫理和道德的限制, 因此臍血干細胞將以其自身的特性和優勢占據重要的位置, 具有重大的理論意義和潛在的臨床應用價值［6］。

1 試劑與方法

1.1 試劑 DMEM培養基(美國Gibco公司)；優質胎牛血清(杭州四季青公司)；重組堿性成纖維生長因子(basic fibroblastgrowth factors, bFGF)、重組表皮生長因子(epidermisgrowth factors, EGF)、β-細胞調節素(PeproTech公司)；β-巰基乙醇(上海試劑四廠)；尼克酰胺、ITS、雙硫腙、B27(GBICO公司)；熒光標記小鼠抗人抗體CD49d、CD34(Bioscience美國)；小鼠抗人胰島素單克隆抗體 (Neomarkers公司)。

1.2 HUCB-MSCs表面標記檢測 取第4代的HUCB-MSCs,經消化后離心, 調節細胞濃度為1×105/ml, 接種有蓋玻片的6孔板內培養, 當細胞生長到融合狀態時, 取出蓋玻片, 再按照試劑盒說明進行免疫細胞化學染色, 實驗組分別滴加50 μl一抗小鼠抗人抗體CD49d、CD34于蓋玻片上, 然后按照常規細胞化學染色方法進行操作。空白對照組用PBS代替一抗。倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.3 體外誘導后胰島細胞檢測

1.3.1 雙硫腙的染色 誘導方法參考［7］。6孔培養板中將誘導約12 d及未誘導的細胞, PBS洗2遍, 然后每個孔分別加入1 ml PBS和10 μl雙硫腙儲存液, 充分混勻, 置37℃孵育20 min后, PBS洗3次, 倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.3.2 免疫細胞化學染色 將誘導12 d的細胞進行常規免疫細胞化學染色, 用小鼠抗人胰島素單克隆抗體作為一抗,參照免疫組化試劑盒說明書進行操作, DAB染色、脫水、透明、封片, 光學顯微鏡下觀察并拍照。對照組用PBS代替一抗。采用圖像分析儀進行結果分析。選取10個高倍鏡的視野計數細胞總數以及陽性細胞數, 計算誘導率。誘導率＝陽性細胞/細胞總數×100%。

1.3.3 統計學方法 采用SPSS11.5軟件處理數據, 計量資料以均數±標準差( x-±s)來表示, 進行t檢驗, P＜0.05表示差異具有統計學意義。

1.4 胰島樣細胞移植造模糖尿病大鼠

1.4.1 大鼠糖尿病模型的制備［8］將12只SD大鼠隨機分為實驗組8只和對照組4只。實驗組大鼠空腹12 h后, 經腹腔注射70 mg/kg鏈脲佐菌素(以0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液溶解), 對照組腹腔注射等體積的生理鹽水。兩組大鼠注射后2 d, 4 d, 6 d從尾靜脈采血檢測空腹血糖, 選連續3次血糖濃度高于16.7 mmol/L(正常值為2.80～7.56 mmol/L)的大鼠作為糖尿病模型。

1.4.2 胰島樣細胞團的移植 8只實驗組分為4只胰島樣細胞組, 4只模型對照組。取2×106個的第4～8代HUCBMSCs用900 μl PBS重懸細胞, 吸入1 ml注射器內經尾靜脈注入糖尿病鼠體內。模型對照組注入等體積的生理鹽水。各組大鼠均于移植前及移植后2 d檢測空腹血糖濃度, 以后每周定點檢測空腹血糖1次。

2 結果

2.1 貼壁細胞鑒定 對第4代貼壁細胞通過免疫細胞化學染色, 結果顯示貼壁的細胞CD49d表達陽性, 細胞質呈棕黃色(見圖1)；而CD34表達陰性, 大部分細胞質未著色, 細胞核為藍色(見圖2)。說明貼壁細胞為HUCB-MSCs。

圖1 CD49d陽性染色 (×200)

圖2 CD34陰性染色(×200)

2.2 誘導胰島細胞的檢測

2.2.1 胰島細胞雙硫腙(DTZ)染色結果 實驗組細胞在DTZ染色的過程中, 多數細胞由貼壁狀態變成懸浮細胞, 只有少數細胞保持貼壁狀態。DTZ是鉛試劑, 與胰島β細胞內豐富的鋅離子結合染成了棕紅色。在倒置顯微鏡下觀察, 經DTZ染色顯示多數細胞為棕紅色(見圖3)。對照組的細胞DTZ染色不著色。

圖3 雙硫腙顯色(棕紅色)×400

圖4 免疫細胞化學胰島素顯色(棕褐色)×200

2.2.2 免疫細胞化學染色 在高糖等誘導環境下, UCB-MSCs聚集成為細胞團, 實驗組細胞可觀察到特異性的胰島素表達,陽性細胞質表現為棕褐色(見圖4)。說明細胞質中有胰島素分泌, 細胞核淡黃色。對照組細胞質染色呈陰性, 不含胰島素。實驗組以及對照組的誘導分化陽性率及灰度值見表1, 表2, 圖5, 圖6。

表1 12 d兔抗人胰島素抗體檢測結果( x-±s, %)

圖5 12 d誘導細胞兔抗人胰島素抗體表達柱形圖

表2 12 d圖像分析系統灰度值測定結果( x-±s) (背景染色：183.3674±3.2865)

圖6 12 d兔抗人胰島素抗體免疫細胞化學結果灰度值比較

2.3 胰島樣細胞團移植效果檢測 血糖濃度正常的大鼠經腹腔注射鏈脲菌素2 d后, 大鼠血糖的濃度迅速升高；4 d、6 d后大鼠血糖濃度均高于16.7 mmol/L。胰島樣細胞移植后2周, 胰島樣細胞組大鼠血糖濃度明顯降低, 模型對照組血糖濃度一直處于糖尿病血糖濃度范圍內(見表3)。

表3 胰島樣細胞移植后不同時間點大鼠空腹血糖濃度的變化( x-±s, n=3, mmol/L)

3 討論

間充質干細胞來源于胚胎發育期的中胚層, 是間充質細胞起源于微環境中的一類多能性前體細胞。近年來UCBMSCs作為一種同質細胞群, 已經被眾多實驗室成功分離。UCB-MSCs不僅在適當的誘導條件下可向外胚層、中胚層、內胚層分化, 而且還有向傷處遷移的能力, 是基礎研究實驗材料的理想細胞和基因治療的載體。本實驗通過免疫細胞化學染色檢測分離培養的細胞表面標記CD49d陽性表達, CD34陰性表達, 由此證明培養的細胞為HUCB-MSCs。

間充質干細胞誘導分化胰島β細胞的誘導因素包括兩類：一類為啟動胰島β細胞特異性轉錄因子的生物因子, 如bFGF、肝細胞生長因子、尼克酰胺等；另一類為誘導 nestin蛋白的表達, 如β-巰基乙醇、DMSO 等［9］。本實驗誘導方案分為三個階段, 第一、二階段HUCB-MSCs形態未見明顯變化, 細胞數量增長速度有所減慢;第三階段相鄰細胞發生明顯的形態變化, 開始逐漸變圓并聚集成胰島樣細胞團, 這些細胞團呈類圓形, 大小不等。誘導后的細胞, 經DTZ染色胰島細胞染成棕紅色, 經胰島素免疫熒光染色檢測, 呈陽性反應, 而對照組則沒有著色。說明HUCB-MSCs 經誘導后得到了胰島素分泌細胞。胰島樣細胞經糖尿病大鼠尾靜脈移植入體內2周后, 糖尿病大鼠空腹血糖濃度明顯下降, 說明胰島樣細胞分泌的胰島素迅速發揮了降血糖的作用, 胰島樣細胞移植可以治療糖尿病。這種HUCB-MSCs移植入糖尿病大鼠體內發揮降血糖作用的優化條件和維持時間將成為今后研究的重點。

［1］ Erices A, Conget P, Minguell JJ.Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood.Br J Haematol, 2000, 109(1):235-242.

［2］ He QL, Wan C, Li G.Concise review: Multipotent mesenchymalstromal cells in blood.Stem Cells, 2007, 25(1):69-77.

［3］ Deans RJ, Moseley AB.Mesenchymal stem cells: Biology and potential clinical uses.Experimental Hematology, 2000, 28 (8):875-884.

［4］ Le Blanc K, Ringdén O.Mesenchymal stem cells: properties androle in clinical bone marrow transplantation.Current Opinion inImmunology, 2006, 18(5):586-591.

［5］ Jang YK, Jung DH, Jung MH, et al.Mesenchymal stem cellsfeeder layer from human umbilical cord blood for ex vivo expandedgrowth and proliferation of hematopoietic progenitor cells.Annalsof Hematology, 2006, 85(4):212-225.

［6］ 籍鳳宇, 李佳佳, 陳秀莉, 等.臍血干細胞向不同體細胞分化的研究進展.生物技術通報, 2012(1):30-36.

［7］ 李偉中, 何紅燕, 王鴻武, 等.體外定向誘導人臍帶間充質干細胞分化為胰島素分泌細胞的研究.中國輸血雜志, 2009, 22(3):192-195.

［8］ 李俊林, 李德華, 趙寶東, 等.人臍帶間充質干細胞體外向胰島樣細胞誘導分化及其治療糖尿病效果.中國組織工程研究與臨床康復, 2009, 13(14):2636-2640.

［9］ 于瑾, 王啟偉, 陳昭烈.間充質干細胞誘導分化為胰島β細胞的研究進展.中國生物工程雜志, 2005, 25(8):6-9.

Inducing human umbilical cord blood mesenchymal stem cells into insulin secreting cells in vitro culture and its effects on diabetes rats

WANG Ying, LUO Hao-hong, GAO Hong-quan, et al. Medical College of Xiamen, Xiamen 361008, China

Objective To explore the possibility of inducing the differentiation of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells(HUCB-MSCs) into insulin secreting cells in vitro and the therapeutic efficacy on diabetic rats following transplantation.Methods We isolated and cultured HUCB-MSCs, and induced HUCBMSCs to differentiate into insulin secreting cells in the islet cell culture condition.HUCB-MSCs of induction were detected by immunocytochemical Methods.Zinchydronium was detected by Dithizon staining.Transplantation efficiency of islet-like cells was detected.Results Under induction, immunocytochemical examination showed that the expression of human insulin was positive.Dithizon stain showed that the cytoplasm of HUCB-MSCs was stained in brownish red color after induction.At 2 weeks following transplantation, blood glucose concentration in the islet-like cell group significantly reduced.Conclusion HUCB-MSCs can be differentiated into insulin secreting cells in vitro.HUCB-MSCs have the potential to become an excellent candidate in β cell replacement therapy of typeⅠdiabetes.

Human umbilical cord blood; Mesenchymal stem cells; Induction; Diabetes rats

2014-03-19］

廈門市科技計劃項目(廈門市衛生局資助)(項目編號：3502Z20089029)

361008 廈門醫學高等專科學校(王英 羅浩虹高洪泉)；廈門市中山醫院(繆智輝)；廈門市中醫院(趙亞清)