金櫻子黃酮兩種提取工藝優化及比較

高品一，金 梅，楊 頔，蔣福宇，張文超，張振學，劉學貴，*

(1.沈陽化工大學制藥與生物工程學院，遼寧沈陽110142;2.沈陽化工大學化學工程學院，遼寧沈陽 110142)

金櫻子(Rose Laevigata Michx.)，又名油瓶果子、糖罐子、黃茶瓶、倒掛金鉤、蜂糖罐等，是薔薇科薔薇屬植物。其根、莖、葉、果、花均可入藥。廣泛分布在我國的東南、西南、華中及華南等地區，是一種開發前景非常好的野生經濟植物。藥理研究顯示金櫻子果實具有抑菌、抗動脈粥樣硬化、促進胃液分泌、降血脂等作用，主要用于治療尿頻遺尿、遺精滑精、久瀉久痢、白帶過多、婦女子宮脫垂等癥［1－5］，其藥理作用可能與黃酮類物質有關系。黃酮類化合物是一類以2－苯基色原酮為基本母核的多酚類化合物，其結構常連接甲基、酚羥基、異戊烯基、甲氧基等官能團。另外它還可以與糖結合形成苷［6］。黃酮類物質廣泛存在于各類植物中，且廣泛應用于化工、食品和醫藥工業中［7］。此外，研究證實從金櫻子中提取出來的黃酮有多種藥理作用，包括抗氧化作用、降血脂的功效，以及保護肝臟的作用等［8－9］。目前，國內外學者對黃酮類物質提取的研究已經成為一個熱點，并且對金櫻子黃酮類化合物提取方法及含量測定的報道較多，如盧俊［10］等利用超聲波輔助法提取金櫻子中黃酮類化合物，黃酮類化合物的提取率為15.28%;薛梅［11］等運用微波提取技術提取金櫻子中黃酮類化合物，測得中藥金櫻子中總黃酮的含量為6.49%。本實驗以金櫻子果實為原料，探討傳統加熱提法及微波助提法提取金櫻子果實中黃酮的工藝，旨在為金櫻子綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金櫻子 江西中藥廠;蘆丁對照品 陜西森弗高科實業有限公司，純度95%;無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等 均為分析純。

HH系列恒溫水浴鍋 江蘇金壇中大儀器廠;旋轉蒸發儀 瑞士步琪有限公司;UV－4100系列紫外可見分光光度計 日本日立;電子天平TD5102 余姚市金諾天平儀器有限公司;SHZ－D(Ⅲ)循環水式真空泵 鞏義市予華儀器責任公司;WP800TL23－K3型微波爐 佛山市順德區格蘭仕微波爐電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的處理 稱取100g中藥金櫻子果實并將其去籽，再粉碎置于培養皿內，然后在105℃烘箱中烘干再研磨成粉末，過40目篩置于干燥的廣口瓶內密封保存。

1.2.2 提取工藝最佳參數的確定 單因素實驗中，在傳統加熱提法和微波助提法的條件下，依次改變提取金櫻子果實中黃酮含量的四個影響因素，即:乙醇濃度(A)、提取時間(B)、提取次數(C)、溶媒量(D)。以黃酮得率作為評價指標進行研究和分析，并確定四因素三水平的最佳參數進行正交實驗分析。實驗中的水平及編碼表見表1，表2。

表1 傳統加熱提法正交實驗因素水平編碼表Table 1 Traditional extraction of facters and levels of orthogonal test

表2 微波助提法正交實驗因素水平編碼表Table 2 Microwave－assisted extraction process of facters and levels of orthogonal test

1.2.3 標準曲線的測定 根據藥典［12］，精密稱取120℃減壓干燥至恒重的蘆丁對照品200mg放置100mL的容量瓶中，加入無水甲醇70mL置于水浴上微熱使其全部溶解。放冷至室溫，加無水甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取10mL置于100mL容量瓶內，加水稀釋至刻度，搖勻。即獲得蘆丁標準溶液(0.2mg/mL)。精密量取蘆丁標準溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL。分別置于 25mL 容量瓶中，各加水至6mL，再加入5%的亞硝酸鈉溶液1mL，搖勻，放置6min。再各加入10%的硝酸鋁溶液1mL，搖勻，放置6min。各加入5%氫氧化鈉溶液1mL，加水至刻度，搖勻放置15min。以第一瓶不加蘆丁對照品的管作為空白對照，在500nm處測其吸光度A。以吸光度A作為縱坐標，濃度 C作為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.4 樣品液中黃酮含量的測定 準確稱取105℃常壓下干燥至恒重的金櫻子果實的浸膏1g研細，加50mL無水甲醇，水浴浸泡24h，超聲20min，重復操作一次，合并濾液，置于100mL容量瓶內，用少量無水甲醇洗滌容器，溶液一起并入容量瓶內，加無水甲醇稀釋至刻度，搖勻，即獲得供試品溶液。量取供試品溶液10mL，置100mL容量瓶內，加水稀釋至刻度，搖勻。再量取4mL，置于25mL容量瓶中。加水至6mL后按1.2.3項操作。在500nm處測其吸光度A，由標準曲線計算樣品液中黃酮的含量，再由下式計算黃酮得率(%，為提取獲得的黃酮占金櫻子果實重量的比率)。

式中:C為測量液黃酮濃度(mg/mL);25為稀釋液體積(mL);W為原料重量(g)。每個實驗平行做三次，計算平均值。

1.2.5 乙醇濃度影響實驗 準確稱取5份10g金櫻子果實粉末分別置于圓底燒瓶中，各加入45%、55%、65%、75%、85%乙醇溶液 100mL，85℃水浴回流提取2次，各回流1h，離心后取上清液按照標準曲線的方法測定其吸光值并計算黃酮得率。以乙醇濃度作為橫坐標，黃酮得率作為縱坐標，繪制黃酮得率隨乙醇濃度變化曲線。

準確稱取5份10g金櫻子果實粉末分別置于圓底燒瓶中，各加入45%、55%、65%、75%、85%乙醇溶液100mL，置于已設定為400W的微波爐中進行微波提取2次，每次8min，離心后取上清液按照標準曲線的方法測定其吸光值并計算黃酮得率。以乙醇濃度作為橫坐標，黃酮得率作為縱坐標，繪制黃酮得率隨乙醇濃度變化曲線。

1.2.6 提取時間影響實驗 準確稱取5份10g金櫻子粉末分別置于圓底燒瓶中，各加入75%乙醇溶液100mL，85℃水浴回流提取 2 次，分別回流30、60、90、120、150min，離心后取上清液按照標準曲線的方法測定其吸光值并計算其黃酮得率。

準確稱取5份10g金櫻子粉末分別置于圓底燒瓶中，各加入75%乙醇溶液100mL，置于已設定為400W的微波爐中進行微波提取2次，每次回流4、6、8、10、12min，離心后取上清液按照標準曲線的方法測定其吸光值并計算其黃酮得率。

1.2.7 提取次數影響實驗 準確稱取5份10g金櫻子粉末分別置于圓底燒瓶中，各加入75%乙醇溶液100mL，分別在 85℃ 水浴下各回流提取 1、2、3、4、5次，回流1h，離心后取上清液按照標準曲線的方法測定其吸光值并計算其黃酮得率。

準確稱取5份10g金櫻子粉末分別置于圓底燒瓶中，各加入75%乙醇溶液100mL，并置于已設定為400W的微波爐中各回流提取 1、2、3、4、5 次，回流1h，離心后取上清液按照標準曲線的方法測定其吸光值并計算其黃酮得率。

1.2.8 溶媒量影響實驗 準確稱取5份10g金櫻子粉末分別置于圓底燒瓶中，各加入75%乙醇溶液80、90、100、110、120mL，85℃水浴回流提取 2 次，每次回流1h，離心后取上清液按照標準曲線的方法測定其吸光值并計算其黃酮得率。

準確稱取5份10g金櫻子粉末分別置于圓底燒瓶中，各加入 75% 乙醇溶液 80、90、100、110、120mL，并置于已設定為400W的微波爐中回流提取2次，每次回流1h，離心后取上清液按照標準曲線的方法測定其吸光值并計算其黃酮得率。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1 標準曲線 按照1.2.3方法，得到回歸方程為:y=9.9571x－0.0188，R2=0.9997，說明對照品在 0.008～0.048mg/mL成良好線性。

2.1.2 乙醇濃度對總黃酮得率的影響 乙醇濃度對總黃酮得率的影響見圖1和圖2。由圖1可知，黃酮得率隨著乙醇濃度的增大而增加，當乙醇濃度超過65%時，黃酮得率逐漸減小。即，當乙醇濃度為65%時，黃酮得率達到最大(約為6.8%)。由圖2可知:黃酮得率隨著乙醇濃度的增大而增加，當乙醇濃度超過65%時，黃酮得率逐漸減小。即，當乙醇濃度為65%時，黃酮得率達到最大(約為7.8%)。

比較:傳統加熱提法和微波助提法提取金櫻子果實中黃酮含量的最佳乙醇濃度為65%。當乙醇濃度偏低或偏高時，黃酮得率均有所降低。這可能是因為中等濃度的乙醇水溶液其極性與金櫻子果實黃酮的極性相近，易于黃酮的溶出;而低濃度的乙醇水溶液其極性比較大，雜質的溶出量大大增加，所得的黃酮含量較低［13］;高濃度的乙醇水溶液具有強烈的吸水作用并且極性較小，影響細胞的溶脹，導致黃酮得率的降低，其主要用于中草藥中的揮發油、樹脂等的溶出［14］。

圖1 傳統加熱提法乙醇濃度對黃酮得率的影響Fig.1 Ethanol concentration on thefalconoid extraction yield by traditional extraction

圖2 微波助提法乙醇濃度對黃酮得率的影響Fig.2 Ethanol concentration on the falconoid extraction yield by microwave－assisted extraction

2.1.3 提取時間對總黃酮得率的影響 由圖3可知:隨著提取時間的增加，黃酮得率也隨之先增加后減少。當提取時間為30～60min時，黃酮得率增加得比較快，且在90min處達到最大值(約為7.9%);當提取時間為90～150min時，黃酮得率略有所下降，這可能是由于提取時間過長，乙醇大量揮發，而且長時間水浴加熱很可能促使金櫻子果實中黃酮類物質的活性成分遭損壞，穩定性變差［15］，直接影響其提取效率。由圖顯示，90min處的黃酮得率較60min處的黃酮得率略高，但兩者相差不大，因而從節能的角度考慮，選擇提取時間為60min更合理。

圖3 傳統加熱提法提取時間對黃酮得率的影響Fig.3 Extraction time on the falconoid extraction yield by traditional extraction

由圖4可知:隨著提取時間的增加，黃酮得率也不斷增加。當提取時間為4～6min時，黃酮得率增加得比較迅速;當6～12min時，黃酮得率增加得比較緩慢。運用微波助提法，在4～12min提取時間范圍內，延長提取時間有利于金櫻子果實中黃酮的提取。但提取時間過長，不但影響實驗進度且浪費資源，所以選6min為最佳提取時間。

圖4 微波助提法提取時間對黃酮得率的影響Fig.4 Extraction time on the falconoid extraction yield by microwave－assisted extraction

2.1.4 提取次數對總黃酮得率的影響 由圖5、圖6可知:回流提取3次，黃酮得率達到最大值。表明回流提取次數越多，得到的黃酮越多。增加回流提取次數對提高黃酮得率有利。但是提取次數過多，不但會影響實驗進展速度，而且也浪費資源。則確定提取次數1、2、3次為正交實驗的三個水平。

圖5 傳統加熱提法提取次數對黃酮得率的影響Fig.5 Extraction times on the falconoid extraction yield by traditional extraction

圖6 微波助提法提取次數對黃酮得率的影響Fig.6 Extraction times on the falconoid extraction yield by microwave－assisted extraction

2.1.5 溶媒量對總黃酮得率的影響 由圖7、圖8可知:隨著乙醇體積的不斷增加，黃酮得率也不斷加大。當溶媒量在8～10倍的范圍內，黃酮得率顯著增加;當溶媒量在10～12倍的范圍內，黃酮得率緩慢增加或基本穩定。這可能是由于溶劑量的不斷增加可以提高金櫻子果實與溶劑之間黃酮類化合物的濃度差，有利于黃酮類化合物向溶劑中擴散［16］，從而增強了黃酮的溶解率，提高了黃酮得率。當溶劑用量達到一定數值時，原料表面與溶劑之間的濃度差對黃酮溶解度的影響減小，則黃酮的得率緩慢增加或基本穩定［17］。考慮到溶劑量過大不僅浪費溶劑，而且還給濃縮帶來一定的困難，所以傳統加熱提法和微波助提法提取金櫻子果實中黃酮含量的最佳溶媒量為10倍。

圖7 傳統加熱提法溶媒量對黃酮得率的影響Fig.7 The amount of solvent on the falconoid extraction yield by traditional extraction

2.2 正交實驗結果與分析

根據單因素實驗可知，乙醇濃度、提取時間、提取次數和溶媒量等因素影響金櫻子果實的黃酮得率。以黃酮的得率為衡量指標，按L9(34)正交表進行正交實驗確定最佳提取工藝條件。

圖8 微波助提法溶媒量對黃酮得率的影響Fig.8 The amount of solvent on the falconoid extraction yield by and microwave－assisted extraction

2.2.1 傳統加熱提法 正交實驗數據處理是采用正交實驗直觀分析的方法，統計不同水平條件下提取出金櫻果實黃酮的平均含量，以極差R(R為極大值與極小值之差)進行分析(見表3)。極差R的結果表明，乙醇濃度、提取時間、提取次數、溶媒量4個因素對金櫻果實總黃酮提取含量的影響的顯著性為:乙醇濃度(A)＞溶媒量(D)＞提取次數(C)＞提取時間(B)。乙醇濃度(A)對黃酮得率有顯著影響，提取次數(C)和溶媒量(D)對結果影響次之，而提取時間(B)對黃酮得率影響不大。表3中k值顯示，最優水平搭配為A3B3C2D2，即10倍溶媒量，用75%乙醇溶解，提取2次，每次70min。

表3 傳統加熱提法正交實驗結果Table 3 Traditional extraction process of orthogonal experimental results in Table

2.2.2 微波助提法 由直觀分析(表4)可見，表中極差結果表明，乙醇濃度、提取時間、提取次數、溶媒量4個因素對金櫻果實總黃酮提取含量的影響的顯著性為:溶媒量(D)＞乙醇濃度(A)＞提取時間(B)＞提取次數(C)。乙醇濃度(A)和溶媒量(D)對黃酮得率有顯著影響，提取時間(B)和提取次數(C)對結果影響不大。表4中k值顯示，最優水平搭配為A2B2C3D2，即10倍溶媒量，用65%乙醇溶解，提取3次，每次6min。

表4 微波助提法正交實驗結果Table 4 microwave－assisted extraction process of orthogonal experimental results in Table

2.3 優化工藝的驗證

取6份金櫻子果實粉末，每份10g。其中3份按照上述傳統加熱提法提取金櫻子果實中黃酮的最佳工藝條件進行提取，即按10倍溶媒量，用75%乙醇溶解，提取2次，每次70min。而另外3份按照微波助提法的最佳工藝條件進行提取，即按10倍溶媒量，用65%乙醇溶解，提取3次，每次6min。將其離心后取上清液按照標準曲線的方法測定其吸光值并計算其黃酮得率，結果見表5。結果表明，兩種提取方法之間存在較大的差異，微波輔助提取18min的黃酮含量(9.06%)就超過了傳統加熱提取140min的效果(7.84%)，大大縮短了黃酮提取所用的提取時間，且微波助提法的黃酮得率平均值為9.06%(RSD=1.01%)，這表明該實驗方案穩定，得率較高，具有實際應用的價值。

表5 優化工藝條件的驗證結果Table 5 Results of the text of optimum process

3 結論

本文通過單因素和正交實驗優化了金櫻子果實中黃酮的提取工藝條件，獲得了穩定性較高且可行的工藝條件，即傳統加熱提法的最佳工藝條件為10倍溶媒量，用75%乙醇溶解，提取2次，每次70min，微波助提法的最佳工藝條件為10倍溶媒量，用65%乙醇溶解，提取3次，每次6min。通過對比，微波助提法不僅大大縮短了提取時間而且所得黃酮含量也比較高。

這兩個最佳工藝條件的獲得，為金櫻子黃酮提取工藝的研究提供了一定的理論依據，具有實際的指導意義和良好的應用前景。

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