NK/T細胞淋巴瘤患者中血漿EB病毒含量檢測及其臨床意義

劉陽 林全德 劉玉章 趙俊梅 王超 喻鳳寬 張龑莉 李玉富 房佰俊

·論著·

NK/T細胞淋巴瘤患者中血漿EB病毒含量檢測及其臨床意義

劉陽 林全德 劉玉章 趙俊梅 王超 喻鳳寬 張龑莉 李玉富 房佰俊

目的 探討外周血中EB病毒檢測在NK/T細胞淋巴瘤中的預后意義。方法 統計本院治療的結外鼻型NK/T細胞淋巴瘤患者56例，應用熒光定量PCR技術檢測外周血中游離EBV-DNA拷貝數，將血漿EBA/DNA含量檢測>0 copies/ml為陽性，分別比較陽性組患者和陰性組患者在疾病分期、B癥狀以及療效之間的差異。結果 45例陽性患者中有29例(64.4%)為晚期(Ⅲ/Ⅳ期)患者，11例陰性患者中3例(27.3%)為晚期(Ⅲ/Ⅳ期)患者，兩組比較差異有統計學意義(P<0.01)；陽性組中伴有B癥狀者27例，明顯高于陰性組患者的2例(P<0.01)。陽性組患者中達CR者17例(37.8%)，低于陰性組患者中達CR者8例(72.3%)，兩組患者差異有統計學意義(P<0.01)。陽性組患者在3年無病生存率及總生存率方面均低于陰性組(3年無病生存率42.2% VS 72.7%，總生存率48.9% VS 81.8%，P<0.05)。結論 NK/T細胞淋巴瘤患者外周血中EB病毒檢測具有一定的預后指導意義。

NK/T細胞淋巴瘤；血漿；EB病毒檢測

目前研究發現NK/T細胞淋巴瘤與EB病毒感染關系密切，尤其是鼻腔NK/T細胞淋巴瘤病例，80%～100%都存在EB病毒感染[1]。有研究顯示，血漿EBV-DNA滴度與疾病的侵襲有關，可以作為一種腫瘤負荷標記，從而對預后具有一定的指導意義[2]。本研究利用熒光定量PCR技術檢測外周血中游離EBV-DNA拷貝數，分析其在鼻型NK/T細胞淋巴瘤中表達的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2005年1月～2010年1月在本科治療的經病理及免疫組化證實的56例結外鼻型NK/T細胞淋巴瘤患者。其中男性38例，女性18例，中位年齡34歲(14～67歲)；年齡<60歲者49例，≥60歲者7例；伴隨B癥狀者17例，無B癥狀者39例，IPI(國際預后指數 IPI) 0～1分者16例，≥2分者38例。對于每位患者治療前、每化療兩周期后、治療結束后均進行外周血EBV-DNA檢測。

1.2 試劑和儀器 DNA濃縮液、DNA提取液、EBV基因擴增試劑盒購自德國Qiaqen公司，7300定量PCR擴增儀購自美國ABI公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 樣本DNA提取 抽取患者2 ml外周血于EDTA抗凝管中，1500 r/min離心后分離上層血漿，取100 μl血漿，用QIA amp Blood Kit試劑盒提取血漿DNA，操作方法按說明書進行。

1.3.2 引物及探針的設計及合成 所擴增的目的基因來自EB病毒的BamH1-W片段。上、下游引物分別為：W-44F(5’-AGTCTCTGCCTCCAGGCA-3’)和W-119R(5’-ACAGAGCGCC TGTCC ACCG -3’)。在該PCR反應體系中加入一個雙末端標記的熒光探針，探針的序列為[5’-(FAM)CACTG TCTGT AAAGT CCAGG CTCC(TAMRA)-3’]。上述引物和探針序列資料采集自Gen Bank序列數據庫。β-actin作為本實驗內參。熱循環參數：93℃ 2 min，1個循環；93℃ 45 s，55℃ 60 s，10個循環；93℃ 30 s，55℃ 45 s，30個循環。采用美國ABI-7300實時FQ-PCR儀進行檢測，檢測步驟、結果判斷以及質量控制方法按操作說明進行。

1.3.3 反應體系組成 PCR反應總體積為50 μl，含有10 ml PCR緩沖液，引物和對應的熒光標記探針各10 pmol，dATP、dCTP、dGTP和dUTP各200 μmol/L，Taq聚合酶5U，DNA模版5 μl，吸取提取的DNA5 μl入PCR反應管中。擴增在自動熒光PCR儀上進行。

1.3.4 對照選擇 每批PCR反應用雙蒸水作陰性對照，克隆合成的EB病毒W片段作為陽性對照，并稀釋成不同濃度梯度(106、105、104、103、102拷貝/μl)進行PCR反應。

1.3.5 血漿中EBA-DNA含量計算 血漿EB病毒DNA拷貝數C=Q×(VDNA/VPCR) ×(1/Vext)，其中C為血漿中待測DNA拷貝數(拷貝/ml)，Q為PCR擴增后計算機檢測的原始DNA拷貝數，VDNA為提取的DNA稀釋液體積，VPCR為用于PCR擴增的DNA體積，Vext為用于提取DNA的血漿體積。血漿EBA/DNA含量檢測>0 copies/ml為陽性。

1.3.6 治療 兩組患者均給予均采用標準的DICE聯合L-ASP方案化療6～8周期：異環磷酰胺1200 mg/m2，第1～3天，靜脈滴注；足葉乙甙65 mg/m2，第1～4天，靜脈滴注；順鉑25 mg/m2，第1～3天，靜脈滴注；地塞米松40 mg，第1～4天，靜脈滴注；L-ASP 7000U/m2，第6～10天，每21天為1個周期，化療前后查血常規、肝腎功能、心電圖、CT、彩超等常規檢查。常規化療結束后所有患者均采取三維適形放療(3D-CRT)，仰臥位下熱塑料面罩固定，CT模擬定位，掃描圖像經局域網傳至三維計劃系統進行重建，計劃設計、計算和評估。放射源采用6 mVX線。中位照射劑量為45Gy(38～50Gy)，采用常規分割2Gy/d，5次/周。

1.3.7 統計學方法 結果采用分析軟件包SPSS 17.0進行分析。多組間及兩組間EBV-DNA拷貝數比較分別采用非參數樣本檢驗，組間EBV/DNA陽性率的比較采用卡方檢驗，組間生存率比較用Log-rank檢驗。

2 結果

2.1 定量標準曲線的建立 用稀釋成不同濃度的陽性對照在擴增儀上進行擴增反應。PCR反應過程中，每8S實時檢測一次產物量，反應結束時，得出PCR擴增的動力學曲線及熒光定量CPR定量標準曲線。

2.2 結果 56例患者中陽性患者45例(80.3%)，陰性患者11例(19.7%)，陽性患者外周血EBV-DNA中位拷貝數為2.4×104copies/ml(7.1×102～2.8×105copies/ml)，45例陽性患者中有29例(64.4%)為晚期(Ⅲ/Ⅳ期)患者，11例陰性患者中3例(27.3%)為晚期(Ⅲ/Ⅳ期)患者，兩組比較差異有統計學意義(P<0.01)；陽性患者中伴有B癥狀者27例(60%)，明顯高于陰性患者中2例(18.2%)伴有B癥狀者(P<0.01)。在完全緩解率(CR)方面，陽性組患者中達CR者17例(37.8%)，低于陰性組患者中達CR者8例(72.3%)，兩組患者差異有統計學意義(P<0.01)。陽性組患者3年無病生存者19例(42.2%)，而陰性組患者中為8例(72.7%)，兩組之間差異有統計學差意義，在3年總生存率比較方面，陽性組(48.9%)低于陰性組的81.8%，兩組之間差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 兩組患者檢測情況及療效比較

3 討論

結外鼻型NK/T細胞淋巴瘤是常發生于亞洲和南美洲，尤其是中國西南比較常見的結外淋巴瘤，其發病率約占所診斷淋巴瘤的10%[3]，可能與中國EB病毒感染發病率較高有一定的關系[4]。NK/T細胞淋巴瘤的臨床病理特征是EB病毒的表達和NK細胞(CD56)及T細胞(細胞毒性分子)的表達[5,6]。早期病灶常局限于鼻腔或鼻咽部，目前病因不明，有文獻報道NK/T細胞淋巴瘤與EBV具有明顯的相關性[7]，EBER陽性率可達80%～90%，此相關性無種族差異[8-10]。隨著分子生物學技術的進展及淋巴瘤發病機制及預后研究進展，越來越多的研究發現EB病毒在NK/T細胞淋巴瘤的發生發展過程中也起到了重要作用，Suzuki等研究報道，NK/T細胞淋巴瘤患者EBV檢測陽性率達90%以上，通過定量檢測患者血清中EBV-DNA發現，DNA拷貝數高者臨床分期較拷貝數低者增高，預后差，提示EBV-DNA檢測可作為判斷NK/T細胞淋巴瘤預后的重要指標[11]。也有研究報道在患者血清中可檢測出高水平的EB病毒DNA拷貝數，并且隨著治療有效而下降，治療無效而升高，可以作為判斷NK/T細胞淋巴瘤的預后因素之一[12]。

本研究發現，56例鼻腔NK/T細胞淋巴瘤患者中EBA/DNA陽性者達45例，占所有患者的80.3%，與報道符合。而外周血游離EBV DNA陽性者往往臨床分期較晚，多為Ⅲ/Ⅳ期患者，且隨著臨床分期進展，拷貝數有上升趨勢，伴有B癥狀者拷貝數明顯高于無B癥狀者(P<0.05)，并且較高的拷貝數患者有著較差的治療效果。本研究病例有限，下一步擬擴大研究例數，并且動態檢測EBA/DNA拷貝數，包括治療前、治療中以及治療后監測，同時根據檢測結果對患者進行預后分層，建立個體化治療策略，以進一步提高鼻腔NK/T細胞淋巴瘤的療效。

[1] Vande Rijn M, Bhargava V, Molina Kirsch H, et al.Extranodal head and neck lymphomas in Guatemala:high frequency of Epstein Barr virus associated sinonasal lymphomas. Hum Patho l,1997,28(7):834.

[2] Zhao-Yang Wang,Qing-Feng Liu,Hua Wang,et al. Clinical implications of plasma Epstein-Barr virus DNAin early-stage extranodal nasal-type NK/T-cell lymphoma patients receiving primary radiotherapy. Blood,2012,120(10):2003-2010.

[3] 劉衛平,李甘地,劉永惠,等.鼻NK/T細胞淋巴瘤-15年研究報道.臨床與實驗病理學雜志,2000,16(2):89.

[4] Chan K C, Zhang J, Chan A T, et al. Molecular characterization of circulating EBV-DNA in the plasma of nasopharyngeal carcinoma and lym-phoma patients.Cancer Res,2003,63(9):2028-2032.

[5] Kim T M, Lee S Y, Jeon Y K, et al. Clinical hetero-geneity of extranodal NK/T-cell lymphoma, nasaltype: a national survey of the Korean Cancer Study Group.Ann Oncol,2008,19(8):1477-1484.

[6] Li Y X, Liu Q F, Fang H, et al. Variable clinical pre-sentations of nasal and Waldeyer ring natural killer/T-cell lymphoma.Clin Cancer Res,2009,15(8):2905-2912.

[7] Mraz-Gernhard S,Natkunam Y,Hoppe R T,et al.Natural killer/natural killer-like T-cell lymphoma,CD56+, presenting in the skin:all increasingly recognized entity with an aggressive course.J Clin Oncol, 2001(19):2179-2188.

[8] 王虎,李曉江,張世文,等.結外NK/T細胞淋巴瘤鼻型臨床研究.中華耳鼻咽喉-頭頸外科雜志,2005,40(11):850-854.

[9] KUO T T,SHIH L Y,TSANG N M.Nasal NK/T cell lymphoma in Taiwan：a clinicopathologic study of 22 cases，with analysis of histologic subtypes，Epstein-Barr virus LMP-1 gene association，and treatment modalities.Int J Surg Pathol, 2004, 12(4):375-387.

[10] Xang-Lan M, Zu-Lan s, Dan H, et a1.Skp2/p27 expression profile is correlated with Epstein-Barr virus status in extranodal nasal-type natural killer cell lymphoma.Transl Res,2008,151(6):303-308.

[11] Suzuki R, Yamaguchi M, Izutsu K, et al. Prospective measurement of Epstein-Barr virus-DNA in plasma and peripheral blood mononuclear cells of extranodal NK/T-cell lymphoma, nasal type.Blood, 2011, 118(23): 6018-6022.

[12] 彭金昀.不同部位和類型惡性淋巴瘤與EBV感染相關性研究.中國腫瘤臨床,2008,35(20):1145-1149.

Clinical significance of plasma EB virus determination in NK/T cell lymphoma patients

LIUYang,LINQuan-de,LIUYu-zhang,etal.

DepartmentofHematology,AffiliatedCancerHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450008,China

Objective To evaluate the prognostic significance of EB virus detection in peripheral blood in NK/T cell lymphoma patients. Methods There were 56 patients with extranodal nasal type NK/T cell lymphoma

therapy in our hospital, the EBV-DNA were detected with fluorescence quantitative PCR in the peripheral blood, it was positive that the plasma EBA/DNA content detection of >0 copies/ml, the differentiation about stage of disease, B symptoms as well as the curative effect between positive group and negative group patients was analyzed respectively. Results There were 29 patients (64.4%) with advanced (stage Ⅲ/Ⅳ) for 45 cases positive patients, and 3 patients (27.3%) with advanced (stage Ⅲ/Ⅳ) for 11 cases negative patients, there was significant difference between two groups (P<0.01),27 cases with B symptoms in positive group was significantly higher than 2 cases in negative group patients (P<0.01).There were 17 cases reach CR (37.8%) in positive group, which was lower than 8 cases in negative group. (72.3%).The 3 years disease free survival rate and overall survival rate of patienrs in the positive group was significantly lower than the negative group patients. Conclusion It will be a prognostic factor that to detect EB virus in peripheral blood of patients with NK/T cell lymphoma.

NK/T cell lymphoma；Plasma；EB virus detection

河南省科技攻關項目社會預研專項(項目編號：20120091007)

450008鄭州大學附屬腫瘤醫院血液科/河南省腫瘤醫院血液科

房佰俊 E-mail：fdation@126.com