孕激素介導uPA在卵巢癌治療中的相關研究

何 芳 朱 艷

·論著·

孕激素介導uPA在卵巢癌治療中的相關研究

何 芳 朱 艷

目的 探討孕激素介導uPA治療卵巢癌的可能機制。方法 傳代培養人卵巢癌細胞HO-8910, 應用Western blot方法檢測對照組(未加孕激素組)和加入含有不同濃度孕激素培養液處理組, 作用72 h后對人卵巢癌細胞HO-8910 uPA表達的影響。結果 Western blot實驗結果表明孕激素能夠抑制uPA的表達, 呈濃度依賴性。結論 孕激素對卵巢癌細胞有抑制作用并且抑制人卵巢癌細胞uPA的表達, 提示孕激素用于卵巢癌的輔助治療可能介導對uPA的影響起作用。

尿激酶型纖溶蛋白酶原激活劑；卵巢癌；孕激素；蛋白印記法

尿激酶型纖溶蛋白酶原激活系統(uPA系統)主要包括尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)﹑uPA特異性受體(uPAR)和纖溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)。uPA能激活無活性纖維蛋白溶解酶原生成纖溶酶, 使纖維蛋白水解成可溶性肽類片段。纖維蛋白溶解參與腫瘤生長和腫瘤細胞的浸入過程, uPA調節細胞外基質蛋白的降解, 并能激活刺激腫瘤生長因子和其他蛋白酶［1］。腫瘤自身分泌的uPA可激活纖溶酶原為纖溶酶, 使基底膜裂開, 有利于腫瘤的侵襲和轉移［2］。

有學者認為：孕激素抑制癌細胞是孕激素作用于癌細胞并與孕激素受體結合形成復合物進入細胞核, 延緩DNA和RNA復制, 抑制癌細胞生長［3］。但其確切機制, 仍不清楚。對于uPA在卵巢癌中的抗原表達及含量國外已有報道, 關于孕激素應用于卵巢癌的輔助治療也有報道。但關于孕激素對卵巢癌細胞中uPA表達的影響目前尚無報道。本研究旨在應用 Western-blot法研究孕激素對人卵巢癌細胞中uPA表達的影響, 從而探討孕激素在卵巢癌輔助治療中的可能機制,為臨床治療卵巢癌提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞來源 卵巢漿液性囊腺癌細胞HO-8910(上海中科院細胞庫)細胞形態及生物學特征均符合卵巢漿液性囊腺癌特征。

1.1.2 實驗試劑

RPMI-1640培養液(大連晨玉)

胰酶 (大連晨玉)

Hepes(大連晨玉)

標準胎牛血清(大連博瑞德)

MTT(大連博瑞德)

uPA兔抗人多克隆抗體(北京博士德)

SP免疫試劑盒(北京中杉)

二甲基亞砜(大連誠銳)

蛋白印記試劑如：NC﹑丙烯酰胺﹑甲基雙丙烯酰胺﹑Tris﹑甘氨酸﹑氯化鈉﹑甲醇﹑冰乙酸﹑脫脂奶粉等(大連博瑞德)

耗材(沈聯化學試劑玻璃儀器有限公司)

1.1.3 主要設備

相差倒置顯微鏡(olympus公司)

CO2孵箱(Forma公司)

常溫臺式離心機(Sigma公司)

超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)

三用水箱(北京醫療設備廠)

多用途水浴恒溫振蕩器(江蘇太倉市實驗設備廠)

電泳儀(大連捷邁生物公司)

轉膜儀(大連捷邁生物公司)

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 ①試劑配置：RPMI-1640細胞培養基：用于培養卵巢癌細胞HO-8910。每升培養液中含RPMI 1640粉劑10.4 g﹑HEPES 4.8 g﹑NaHCO32.0 g﹑經滅活的胎牛血清(FCS)100 ml﹑青霉素及鏈霉素各100 U/ml, 調節pH=7.4,抽濾滅菌, 分裝, 4 ℃保存。PBS (10×)：稱取NaCl 8.5 g, Kcl 0.2 g, Na2HPO4·12H2O 2.85 g, KH2PO40.24 g, ddH2O 100 ml, 調pH=7.4, 高壓滅菌, 保存于4℃。②細胞培養：人卵巢癌細胞HO-8910常規培養于含10%胎牛血清﹑雙抗的RPMI-1640完全培養基中。置37℃﹑5%CO2培養箱內培養, 相對濕度90%, 培養至70%～80%融合時, 0.25%胰蛋白酶消化﹑傳代。當細胞達到一定數量后, 細胞記數, 將一定數量細胞分別培養在4個大培養瓶中, 第2天待細胞貼壁后置入4℃恒溫箱1 h,促成細胞同步化生長, 然后加入等量的含不同濃度孕激素的培養液, 繼續培養72 h。作用72 h后將4個培養瓶中的細胞消化下來離心收集, 保存在-70℃冰箱中備用。

1.2.2 MTT比色法 取對數生長期的人卵巢癌細胞HO-8910, 5×10-3/孔細胞數接種于96孔板, 置37℃﹑5%CO2培養箱內培養, 第2天大部分貼壁后置入4℃恒溫箱1 h, 促成細胞同步化生長, 棄上清, 然后加入含有從1×10-4mol/L倍比稀釋至0.03125×10-4mol/L(由于孕激素是用酒精溶解為避免酒精對卵巢癌細胞有抑制作用故選取的酒精濃度＜1%)孕激素的等量培養液中, 并設陰性對照(不加孕激素組)﹑空白對照(不加細胞組)及1%酒精組, 共8組, 每組設4個副孔,培養48 h﹑72 h后, 各孔加入20 μlMTT溶液(濃度5 g/l), 輕輕震蕩培養板, 繼續孵育4 h, 輕輕吸棄孔內培養上清液, 每孔加入DMSO溶液150 μl, 輕輕震蕩15 min, 測A-580值。重復3次。篩選出合適的作用時間和孕激素濃度進行Western blot實驗。

1.2.3 Western blot法 ①提蛋白：收集用含有終濃度為0.5×10-5﹑1×10-5﹑0.5×10-4mol/L孕激素培養液處理72 h后的人卵巢癌細胞HO-8910, 離心2500 rmp, 10 min;棄上清,用2 mlPBS吹吸洗滌細胞沉淀, 離心2500 rpm, 10 min;棄去上清, 用1 mlPBS吹吸洗滌細胞沉淀, 轉入1.5 mlEP管, 棄凈上清, 加入細胞裂解液, 超聲震蕩器震蕩, 4℃離心3000 rpm, 5 min, 提取上清, 取上清保存-20℃。②測蛋白：用754法測定蛋白含量, 計算上樣量。③配膠：將配制好的12% SDS-PAGE分離膠溶液5 ml混勻后立即將其注入邊條厚度為1.5 mm凝膠玻璃板內, 至梳齒下約1 cm, 表面加100 μl無水乙醇封住15 min后膠凝固將無水乙醇倒掉, 用蒸餾水清洗, 濾紙吸干。見表1。配制5%濃縮膠3 ml將其灌滿, 立即傾斜插入梳子, 凝固1 h, 用蒸餾水沖洗, 加入TBE。見表2。④上樣：每孔上樣量為30 μl, 將蛋白質樣品與樣品緩沖液在小EP管中混勻, 100℃加熱3 min, 離心1 s, 用微量注射器將樣品加入樣品孔中, 進行電泳。其中一孔加入蛋白質分子量Marker。⑤電泳：插好電極, 當染料的前沿遷移至凝膠的底部約需2 h。電泳結束后, 關閉電源, 從電極上拔掉電極插頭, 將凝膠玻璃板從電泳槽中取出, 小心移動兩玻璃板之間的隔片, 輕輕撬開玻板, 使凝膠貼在其中的一塊板上。⑥轉膜及染色：電泳后將凝膠浸入轉移緩沖液1 h, 濾紙和硝酸纖維素膜剪成與凝膠同樣大小, 于轉移緩沖液中浸泡30 min, 按順序將硝酸纖維素膜﹑凝膠﹑濾紙放好, 用玻璃棒將各層之間的空氣趕走進行轉膜1 h, 轉移后將硝酸纖維素膜和凝膠麗春紅染色, 觀察條帶。⑦封閉及雜交 硝酸纖維素膜TBS漂洗﹑加脫脂奶粉封阻過夜﹑加一抗37℃1 h﹑TBS漂洗3次﹑加二抗37℃1 h﹑TBS漂洗3次﹑加酶標37℃1 h﹑TBS漂洗3次。⑧顯色：取DAB顯色試劑, 在暗室內與硝酸纖維素膜搖動孵育1 min, 顯色, 數碼照相。經凝膠成像系統分析。

表1 12%的分離膠

表2 5%濃縮膠

2 結果

正常對照組和孕激素處理組卵巢癌細胞HO-8910中uPA的表達量, 見圖1。

實驗結果, 孕激素能夠抑制卵巢癌細胞HO-8910 uPA的表達, 并且呈濃度依賴性。

經凝膠成像系統分析結果如圖2。

圖1 不同濃度孕激素對卵巢癌細胞uPA表達的影響

圖2 經凝膠成像系統分析

3 討論

卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤之一, 死亡率很高。手術與化療是治療卵巢癌的主要手段, 激素療法僅用于卵巢癌的輔助治療或對化療耐藥病例的姑息性治療。由于激素療法的副反應小, 毒性低, 且有一定的療效, 因而越來越受到臨床的關注［4］。

本實驗應用MTT比色法發現孕激素對人卵巢癌細胞HO-8910有抑制作用, 作用72 h后對人卵巢癌細胞HO-8910有明顯的抑制作用。近年來許多研究提示孕激素可降低卵巢癌的危險性, 卵巢癌血清孕激素水平高者, 生存率提高［5］。陳曉軍等［6］以已行瘤體減滅術的卵巢癌患者1～4期為研究對象, 分為單純化療組﹑己酸孕酮組和普維拉組。隨訪﹑統計各組各期患者的生存率及復發率﹑血清激素水平﹑骨密度變化及化療反應, 結果顯示孕激素聯合以鉑類為主的常規化療可以改善晚期卵巢癌的預后, 并且不增加化療的毒副作用, 可改善患者的骨量丟失。通過MTT比色法篩選出對卵巢癌細胞的抑制作用較明顯的合適濃度進行Western blot實驗, 檢測孕激素對uPA的影響, 結果發現,孕激素的濃度越大, uPA的表達越弱, 通過條帶分析發現含量也越少, 說明孕激素能夠抑制uPA的表達。但孕激素做為卵巢癌治療的輔助藥物, 其作用機制不很清楚。檢測孕激素對uPA表達的抑制, 也許正是孕激素抑制卵巢癌細胞生長的一條重要途徑, 可能是孕激素介導對uPA的表達而發揮治療作用。由于本實驗選取的人卵巢癌細胞為漿液性囊腺癌細胞, 存在局限性, 不能說明對所有卵巢癌病理分型都有作用, 還有待于進一步的研究。并且在基因水平上還需要進一步研究, 探討孕激素對uPA mRNA的影響及其可能機制。用激素替代治療為卵巢癌患者提供了新的非手術的輔助治療方法, 但是關于激素治療卵巢癌對人體是否會產生副作用目前還存在很大爭議, 有必要進行臨床跟蹤隨訪。以uPA為靶點開發出更多治療卵巢癌的導向藥物, 將成為新的研究熱點。

孕激素對卵巢癌細胞有抑制作用并且抑制人卵巢癌細胞uPA的表達, 提示孕激素用于卵巢癌的輔助治療可能介導對uPA的影響起作用。本實驗選取的人卵巢癌細胞為漿液性囊腺癌細胞, 存在局限性, 不能說明對所有卵巢癌病理分型都有作用, 還有待于進一步的研究。并且在基因水平上還需要進一步研究, 探討孕激素對uPA mRNA的影響及其可能機制。用激素替代治療為卵巢癌患者提供了新的非手術的輔助治療方法, 但是關于激素治療卵巢癌對人體是否會產生副作用目前還存在很大爭議, 有必要進行臨床跟蹤隨訪。

［1］ Baker MS, Bleakey P, Woodrow GC, et al.Jnhibitor PAI and subsequent effects on extracellular matrix degradation.Cancer Res, 1990, 50(10):4676-4684.

［2］ Herszyi L, Farinati F, PLebani M, et al.The role of cathepsins and the plasminogen actionary inhibitior systemin colorectal cancer.Orv Hetil, 1999, 140(33):1833-1836.

［3］ Akhmedkhanov A, Zeleniuch - Jacquotte A, Toniolo P.Role ofexogenous and endogenous hormones in endometrial cancer: reviewof the evidence and research perspectives.Ann NY Acad Sci , 2001, 43(12): 296-302.

［4］ 岳天孚, 張士偉.卵巢癌的內分泌治療.中國實用婦科與產科, 1996, 6(12):328-329.

［5］ Bu SZ, Yin DL, Ren XH, et al.Progesterone induces apoptosis and upregalation of p53 expression in huruan ovarian carcinoma cell lines.Cancer, 1997, 79(10):1944.

［6］ 陳曉軍, 豐有吉.孕激素聯合化療治療卵巢上皮性癌.復旦學報(醫學版), 2003, 30(3):273-276.

Study about progestogen mediating uPA in ovary cancer treatment

HE Fang, ZHU Yan

Shenyang Womenand Infats Hospital, Shenyang 110000, China

Objective To discuss the possible mechanism of treating ovary cancer by progestogen mediating uPA Methods Serial subcultivated human ovary cancr cell HO-8910 and then two groups were divided, the control group(no progestogen added) and the group of progestogen culture fluid of different concentration added.After effection of 72 hours , western blot was used to detect the different expression of uPA in human ovary cell HO-8910 in the two groups.Results The results of western blot indicated that progestogen might inhibit the expression of uPA and to be present concentration dependent.Conclusion The inhibitory effection of progestogen to the ovary cancer cells and the expression of uPA of human ovary cancer cells indicated that progestogen might be adjunctive therapy of ovary cancer by mediating uPA.

Urokinase piasminogen activator(uPA); Ovarian cancer; Progestogen; Western blot

110000 遼寧省沈陽市婦嬰醫院產一科(何芳)； 遼寧醫學院附屬第一醫院婦產科(朱艷)