兩面針葉抗菌活性部位研究

黃依玲 馮潔 賴茂祥

[摘要] 目的 研究兩面針葉不同溶劑萃取部位對6種菌株的抗菌活性，為評價兩面針葉抗菌活性部位提供實驗依據。 方法 應用液體試管兩倍稀釋法測定兩面針葉不同提取部位對大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、副溶血性弧菌等菌株進行最低抑菌濃度和最低殺菌濃度測定。 結果 乙酸乙酯部位對其中的4個菌株有抑菌活性，它們的抑菌活性依次為：副溶血性弧菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌；正丁醇部位對白色念珠菌的抑菌活性最好，其最低殺菌濃度（MBC）和最低抑菌濃度（MIC）分別為750 μg/mL和375 μg/mL；水層對副溶血性弧菌抗菌活性最強；其MBC和MIC分別為750 μg/mL和375 μg/mL。 結論 乙酸乙酯部位、正丁醇部位及水層對白色念珠菌、副溶血性弧菌均有較好的抗菌活性，可考慮綜合應用兩面針葉在抗菌活性方面的應用與研究。

[關鍵詞] 兩面針葉；抗菌活性；最低抑菌濃度

[中圖分類號] R284.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）07（c）-0013-04

兩面針Zanthoxylum nitidum（Roxb.） DC.為蕓香科花椒屬植物，作為中草藥使用在民間已有悠久歷史，其性味辛、苦、微溫，有小毒，具有祛風通絡、活血化瘀、行氣止痛和消腫解毒之功效，用于治療牙痛、胃痛、神經痛、咽喉腫痛、風濕痹痛、毒蛇咬傷及燒燙傷等。兩面針作為中藥材收載于《中國藥典》2010版[1]，現代研究證明，兩面針的提取物具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗癌及抗菌作用[2-10]，并對心血管系統(tǒng)和神經系統(tǒng)有顯著的藥理作用[11-12]。兩面針為廣西特色中草藥資源植物，因其臨床療效好、用途廣而至使市場上兩面針藥材供不應求。本研究組前期研究對兩面針根和莖的抗炎鎮(zhèn)痛不同部位活性及其抗菌部位進行了活性研究報道[13-14]，在前期研究基礎上，本研究組繼續(xù)開展兩面針葉的抗菌藥理活性實驗，為尋找活性先導化合物或抗菌活性化學成分及考察是否可合理地擴大兩面針藥用植物資源提供科學的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗藥物

兩面針葉采自廣西壯族自治區(qū)南寧市邕寧縣，涼干后粉碎成粗粉，生藥標本由廣西中醫(yī)藥研究院賴茂祥研究員鑒定為蕓香科（Rutaceae）花椒屬植物兩面針Zanthoxylum nitidum（Roxb.） DC.植物的葉，憑證標本存放于廣西醫(yī)科大學藥學院。兩面針葉先用70%乙醇浸泡過夜，再回流提取4次，合并提取液，減壓濃縮得稠膏，再以水一定比例的水混懸，接著用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇分別依次萃取，濃縮得相應不同極性部位稠膏，冷凍干燥，將所得的各極性部位分別記為兩面針葉的70%乙醇提取物（A）、乙酸乙酯部位（B）、正丁醇部位（C）及水層（D），并密封置冰箱中冷藏，臨用前用磷酸緩沖液（pH=6.8）加10%DMSO溶解，配成1.5 mg/mL的母液，經0.22 μm微孔濾膜過濾，再逐級稀釋成不同藥液濃度。

1.1.2 菌種及培養(yǎng)基

乙型副傷寒沙門菌[CMCC（B）50094]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、藤黃八疊球菌[CMCC（B）28001]、短小芽孢桿菌[CMCC（B）63202]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、福氏志賀菌[CMCC（B）51572]均來源于廣西食品藥品檢驗所；表皮葡萄球菌[CMCC（B）26069]、乙型溶血性鏈球菌[ATCC17802]、單核細菌增生李斯特菌[CMCC（B）21663]、副溶血性弧菌[ATCC17802]購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。MH瓊脂培養(yǎng)基（批號3101197）、MH肉湯培養(yǎng)基（批號201111072）購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；改良馬丁培養(yǎng)基（批號110302）、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號120320）、液體沙氏培養(yǎng)基（批號101130）、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號110118）及營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號110406）均為北京路橋技術有限公司產品。

1.1.3 儀器

SPX-150型生化培養(yǎng)箱、BIO1200-Ⅱ-A1生物安全柜、LRH-250-G光照培養(yǎng)箱、LMQ·C/3260J立式壓力蒸汽滅菌器。

1.2 方法

實驗所用的的試管、培養(yǎng)基及溶劑等均經高壓滅菌。

1.2.1 菌液的制備

1.2.1.1 菌種復蘇 取各凍存管中的乙型副傷寒沙門菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、藤黃八疊球菌、短小芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、福氏志賀菌、表皮葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、單核細菌增生李斯特菌、副溶血性弧菌分別至一定量的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，混勻，并置于35～36℃下培養(yǎng)18～24 h；將取自凍存管的白色念珠菌置改良馬丁培養(yǎng)基中，混勻，23～28℃培養(yǎng)18～24 h。

1.2.1.2 實驗菌液制備 細菌菌懸液：分別接種大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、藤黃八疊球菌、短小芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、福氏志賀菌表皮葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、單核細菌增生李斯特菌、副溶血性弧菌至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35～36℃下培養(yǎng)18～24 h，作為各菌株的菌懸液。使用時用0.9%氯化鈉溶液進行10倍系列稀釋至所需濃度，計數。

真菌菌懸液：將白色念珠菌接種至改良馬丁培養(yǎng)基中，25～28℃下培養(yǎng)24～48 h，作為菌懸液。使用時用0.9%氯化鈉溶液對其進行10倍系列稀釋至所需濃度，計數。

1.2.2 實驗方法

1.2.2.1 預實驗（平板挖溝法） 在瓊脂平板中間挖一條寬5～10 mm的溝，注入藥液。然后分別接種乙型副傷寒沙門菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、藤黃八疊球菌、短小芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、福氏志賀氏菌、表皮葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、單核細菌增生李斯特菌、副溶血性弧菌等13個受試菌，接種時，每1種菌劃一條橫越藥溝的接種線，每個平板接種3～4種菌株。經適宜溫度培養(yǎng)18～24 h后，觀察溝旁細菌生長情況，以抑制距離的長短判斷受試藥物的抑菌作用和抑菌強度。

1.2.2.2 最低抑菌濃度（MIC）測定 用0.22 μm微孔濾膜將供試藥液過濾除菌。取13支試管，每支試管加入MH肉湯培養(yǎng)基1.0 mL，再將1.0 mL供試藥液加入第1管中混勻，然后吸取1.0 mL加入第2管中混勻，同法操作稀釋至第12管，再從第12管中吸出1.0 mL置空試管中作空白對照，第13管作為陽性生長對照管，并將MH肉湯培養(yǎng)基和樣品溶劑各0.5 mL加入另1空試管中作為溶劑對照管。除空白對照管外，各實驗管均分別加入相應的菌懸液0.1 mL，各菌懸液濃度分別為：乙型副傷寒沙門菌1.3×104 CFU/mL、枯草芽孢桿菌6.1×104 CFU/mL、大腸埃希菌4.5×105 CFU/mL、副溶血性弧菌1.5×104 CFU/mL、金黃色葡萄球菌8.3×104 CFU/mL、白色念珠菌1.8×104 CFU/mL，使各實驗液含菌終濃度為103～104 CFU/mL，混勻。將對枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌的各實驗管置于35～36℃下培養(yǎng)18～24 h，把白色念珠菌的實驗管置25～28℃下培養(yǎng)24 h；取出觀察結果，以搖勻后仍澄明（未見長菌）的最高稀釋度作為實驗藥物的最低抑菌濃度。

1.2.2.3 最低殺菌濃度（MBC）測定 取最低抑菌濃度測定后的實驗管，依次從對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、副溶血性弧菌實驗未見長菌的各實驗管中，分別吸取0.1 mL的培養(yǎng)物涂布于MH瓊脂培養(yǎng)基平板上，置30～35℃下培養(yǎng)24 h；再從對白色念珠菌實驗未見長菌的實驗管中，吸取0.1 mL培養(yǎng)物分別涂布于玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，于25～28℃下培養(yǎng)24 h；取出觀察記錄結果，以平板上小于5個菌落數的最小稀釋度的藥物濃度作為最低殺菌濃度。

2 結果

2.1預實驗結果

兩面針葉藥液對上述13種受試菌株的實驗中提示對乙型副傷寒沙門菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、副溶血性弧菌6株菌有抑菌作用。故取實驗藥液對后者分別進行最低抑菌濃度、最低殺菌濃度測定，同時，取硫酸慶大霉素分別對大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、枯草芽孢桿菌，取兩性霉素B對白色念珠菌進行最低抑菌濃度作為對照。

2.2 MIC測定結果

兩面針葉藥液乙酸乙酯部位（B）、正丁醇部位（C）及水層（D）對白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌均有不同程度的抗菌活性；對大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌無抑菌活性，70%乙醇提取物（A）對所實驗的6種菌株未見有抑菌活性。見表1。

2.3 MBC測定結果

實驗藥液乙酸乙酯部位（B）、水層（D）和正丁醇部位（C）對副溶血性弧菌和白色念珠菌的MBC均為750 μg/mL。見表1。

3 討論

本次實驗在對所研究的6個菌株中發(fā)現：除70%乙醇提取物，其余樣品對白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌有抗菌活性，其中對白色念珠菌、副溶血性弧菌的抗菌活性最佳，對白色念珠菌的MIC為375 μg/mL（乙酸乙酯部位、正丁醇部位）、750 μg/mL（水層），MBC為750 μg/mL（正丁醇部位）；乙酸乙酯部位、正丁醇部位對副溶血性弧菌的MIC均為375 μg/mL， MBC均為750 μg/mL；樣品乙酸乙酯部位、正丁醇部位對枯草芽孢桿菌和樣品乙酸乙酯部位、水層對金黃色葡萄球菌的MIC均為750 μg/mL。

兩面針為多年生木質藤本植物，傳統(tǒng)入藥部位為根，廣泛應用于精細化工、醫(yī)藥產品及中醫(yī)處方中，因其生長周期長，市場用量大，有供不應求現象。文獻報道兩面針不同部位所含主要成分有別[15-16]，本研究組推測兩面針植物的不同入藥部位功效可能也有所不同，因而目前開展了兩面針根、莖和葉不同提取部位的抗菌和抗炎鎮(zhèn)痛活性實驗[2，8，14]，本實驗研究兩面針葉的抗菌活性部位，為尋找抗菌活性化學成分或活性先導化學成分提供前期研究基礎，為兩面針植物資源的綜合利用提供實驗依據。

白色念珠菌作為重要的條件致病性真菌是引起根尖周炎，特別是頑固性根尖周炎及根管治療失敗三大菌種之一。近年來，隨著廣譜抗生素的大量使用及皮質類固醇激素的廣泛使用，導致致病性白色念珠菌感染日漸增多，而抗真菌藥物的大量使用使白色念珠菌的耐藥現象越來越普遍，日益嚴重的耐藥現象使白色念珠菌感染成為臨床上迫切需要解決的問題[17-19]。副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）作為廣泛存在于海產品中的一種人畜共患病原菌，是人類食源性疾病最重要的病原之一，是細菌性食物中毒的重要致病菌。我國每年引起食物中毒的微生物病原中，該菌占首位[20]。由于水產養(yǎng)殖業(yè)中抗生素的大量使用，導致了副溶血性弧菌耐藥性日益嚴重[22-23]，其耐藥菌株可通過食物鏈進入人體，給目前的臨床治療帶來巨大挑戰(zhàn)。尋找、研發(fā)新型的抗菌藥物迫在眉睫。

本實驗中，兩面針葉的乙酸乙酯部位對白色念珠菌、副溶血性弧菌有較好抑菌活性，正丁醇部位對白色念珠菌、水層對副溶血性弧菌的抗菌活性最強，70%乙醇總提取物沒有表現出對實驗菌株的抑菌活性，原因可能與實驗抗菌的有效成分濃度較低有關。此研究為本研究組進一步深入研究兩面針資源、尋找新的抗白色念珠菌、抗副溶血性弧菌的抗菌活性成分或開發(fā)植物源抗菌素新藥研究提供科學實驗依據。

[參考文獻]

[1] 國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社出版，2010：157.

[2] 韋錦斌，周勁帆，馮潔，等.兩面針葉不同提取部位的抗炎鎮(zhèn)痛作用研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2013，24（2）：122-125.

[3] 樊潔，李海霞，王炳義，等.兩面針中化學成分的分離鑒定及活性測定[J].沈陽藥科大學學報，2013，30（2）：100-105，131.

[4] 韓正洲，仰鐵錘，陳煒璇，等.兩面針不同藥用部位鎮(zhèn)痛和保護胃黏膜作用的研究[J].中國現代中藥，2013，（3）：178-182.

[5] 葉玉珊，劉嘉煒，劉曉強，等.兩面針根抗菌活性成分研究[J].中草藥，2013，44（12）：1546-1551.

[6] 王希斌，劉華鋼，楊斌，等.兩面針中木脂素化合物結晶-8對傷害性疼痛大c-fos基因表達的影響[J].醫(yī)藥導報，2012，31（9）：1113-1116.

[7] 肖開，閆欣，苗明三，等.兩面針外用對豚鼠口腔潰瘍模型的影響[J].中藥新藥與臨床藥理，2012，23（5）：533-537.

[8] 周勁帆，覃富景，馮潔，等.兩面針根揮發(fā)油的抗炎鎮(zhèn)痛作用研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2012，23（1）：19-20.

[9] 徐露，黃彥，董志，等.兩面針總堿對潰瘍性結腸炎大鼠抗炎作用的實驗研究[J].中國中醫(yī)急癥，2010，19（3）：480.

[10] 龐輝，何惠，簡麗娟，等.兩面針總堿抗胃潰瘍作用研究[J].中藥藥理與臨床，2007，23（1）：38.

[11] 劉華鋼，黃秋潔，賴茂祥.中藥兩面針的研究概況[J].時珍國醫(yī)國藥，2007，18（1）：222-223.

[12] 李艷芝，王慧云.兩面針化學成分及其藥理活性研究進展[J].中國藥房，2013，24（31）：2966-2968.

[13] 馮潔，周勁帆，覃富景，等.兩面針根和莖抗炎鎮(zhèn)痛不同部位活性比較研究[J].中藥藥理與臨床，2011，27（6）：60-63.

[14] 黃依玲，馮潔，王海華，等.兩面針根和莖的抗菌部位研究[J].中藥藥理與臨床，2013，29（1）：103-105.

[15] 張守堯，巍育法，劉楚峰.不同部位兩面針藥材中兩面針堿的含量測定[J].中藥材，2001，24（9）：649-650.

[16] 張守堯，周本杰，汪艷.高效液相色譜法測定不同部位兩面針原植物中L-芝麻脂素和L-細辛脂素的含量[J].第一軍醫(yī)大學學報，2002，22（7）：654-655.

[17] 許穎，郭婧玉，劉學，等.飛龍掌血乙醇提取物對白色念珠菌抑菌作用的研究[J].中國實驗方劑學雜志，2012， 18（10）：270-274.

[18] 趙德軍，付維嬋，胡昭宇，等.我院2009-2011年白色念珠菌檢出率及其對氟康唑的耐藥性變遷[J].中國藥房，2013，24（2）：146-148.

[19] 符健，賈杰，蔡篤運.白色念珠菌對臨床常用抗真菌藥物的耐藥性分析[J].現代預防醫(yī)學，2011，38（16）：3301-3302.

[20] 劉秀梅，陳艷，郭云昌，等.2005年中國食源性疾病暴發(fā)事件監(jiān)測資料分析[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2008，20（6）：506-509.

[21] 胡婕，陳茂義，胡靜榮.內陸地區(qū)市售水產品及環(huán)境中副溶血性弧菌血清群分布與耐藥性[J].公共衛(wèi)生與預防醫(yī)學，2013，24（6）：32-35.

[22] 傅慧琴，蘇靖華，章紅紅.318株副溶血性弧菌的血清分型和耐藥性分析[J].疾病監(jiān)測，2011，26（7）：539-542.

[23] 張育禾，徐麗萍，張朝陽，等.寧波地區(qū)副溶血性弧菌耐藥性與分型[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2013，23（1）：28-32.

（收稿日期：2014-04-20 本文編輯：蘇 暢）