異丙酚對大鼠腦損傷后腦組織MMP-9表達的影響

孫正清 蓋成林 蘇芳 楊天德

·論著·

異丙酚對大鼠腦損傷后腦組織MMP-9表達的影響

孫正清 蓋成林 蘇芳 楊天德

目的觀察異丙酚對大鼠腦損傷后腦組織MMP-9表達的影響，探討異丙酚的腦保護作用機制。方法91只雄性Wistar 大鼠隨機分為假手術組、傷后0.9%氯化鈉溶液組、傷后異丙酚治療組。異丙酚給藥量為臨床麻醉相關劑量(100 mg/kg)：冷凍傷后15 min腹腔注射異丙酚50 mg/kg，1次/2 h后再次追加相同劑量。采用顱骨外腦冷凍傷法，運用液氮冷凍器局部冷凍大鼠左側頂部腦組織60 s制作冷凍傷即腦損傷模型。分別于冷凍傷后2、6、24 h處死并收集腦組織標本，采用干濕重法測定腦水含量，RT-PCR法檢測MMP-9基因的mRNA表達，免疫組化法測定MMP-9的蛋白表達。結果傷后0.9%氯化鈉溶液組在傷后各時點傷側腦組織含水量均顯著高于假手術組(P<0.01)，腦冷凍傷后24 h最高；在傷后6 h、24 h，傷后異丙酚治療組腦組織含水量與0.9%氯化鈉溶液組比較均顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05或<0.01)。假手術組腦組織MMP-9 mRNA水平表達很低，腦冷凍傷后2 h,0.9%氯化鈉溶液組MMP-9 mRNA水平較假手術組明顯升高，6 h最高，24 h仍保持在較高水(P<0.01)；在傷后6 h及24 h，傷后異丙酚治療組腦組織MMP-9 mRNA水平與0.9%氯化鈉溶液組比較均顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05或<0.01)。假手術組腦組織MMP-9蛋白未見明顯陽性表達，腦冷凍傷后2 h,0.9%氯化鈉溶液組MMP-9蛋白陽性表達水平較假手術組明顯升高，6 h最高，24 h仍保持在較高水平(P<0.01)；在傷后6 h及24 h，傷后異丙酚治療組腦組織MMP-9 蛋白表達水平與0.9%氯化鈉溶液組比較均顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05或<0.01)。結論臨床麻醉相關劑量的異丙酚可以減輕腦損傷后腦水腫。此種作用可能與異丙酚抑制MMP-9的表達有關。

異丙酚;腦創傷;基質金屬蛋白酶-9;腦水腫

腦水腫是顱腦損傷最常見、最嚴重的繼發損傷之一，也是顱腦損傷患者致死致殘的重要原因。創傷性腦水腫是一種混合型腦水腫。由于血管源性腦水腫在創傷性腦水腫的形成、顱內壓增高及繼發性腦損害中的重要作用，以保護顱腦損傷后血腦屏障，減輕血管源性腦水腫的救治措施成為備受關注的課題。近期的研究顯示全麻藥異丙酚可以減輕創傷性腦水腫[1]，降低缺血性腦損傷后血腦屏障通透性，促進血腦屏障功能的恢復[2]。但異丙酚通過何種機制來達到此種腦保護效應研究尚少。近期，基質金屬蛋白酶(MMPs)在血管源性腦水腫的研究中受到廣泛關注。腦損傷后MMP-9表達增高，參與血腦屏障破壞及繼發性腦損害[3，4]。本研究我們采用腦冷凍傷這一經典的血管源性腦水腫模型，以異丙酚腹腔注射為干預，觀察異丙酚對腦損傷后MMP9的影響，探討異丙酚的創傷性腦保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 清潔級雄性 Wistar 大鼠91 只，體重230 ～250 g，由第三軍醫大學大坪野戰外研所提供。隨機分為假手術組：只切開頭皮而未行冷凍傷處理；傷后0.9%氯化鈉溶液組：冷凍傷后15 min腹腔注射0.9%氯化鈉溶液5 ml/kg,0.5 h后再次追加相同劑量，根據觀察時間不同，分為3個亞組，即冷凍傷后2、6、24 h組；傷后異丙酚治療組：冷凍傷后15 min腹腔注射異丙酚50 mg/kg，0.5 h后再次追加相同劑量，也分為2、6、24 h 3個亞組。其中49只用于測量腦組織含水量及檢測腦組織MMP-9 mRNA的表達(假手術組及每個亞組均含7只)，42只用于MMP-9免疫組化檢測(假手術組及每個亞組均含6只)。

1.2 動物模型制備 參照文獻[5]的方法制備動物模型。1%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔麻醉大鼠，待角膜及翻正反射消失后，俯臥位固定于立體定位儀上，碘氟消毒頭部皮膚，沿正中切開頭皮，分離骨膜，暴露左頂顱骨。將內盛丙酮的冷凍器直接浸泡入液氮中預冷，使冷凍器溫度為液氮溫度(-196℃)。將直徑5 mm冷凍頭垂直置于矢狀縫左旁開5.5mm為圓心的骨面上(冷凍頭前緣至冠狀縫)，冷凍60 s，造成左頂葉腦皮層的冷凍傷。手術室溫度為25℃，術中電燈泡照射維持肛溫為37～37.5℃。術畢自由進食水。

1.3 腦水含量測定 采用干濕重法。在各個時間點，大鼠斷頭取腦，去除小腦及腦干，在凍傷灶周圍(距凍傷灶3 mm內的左半球后1/2部分)取大小約110 mg腦皮質全層組織塊(包括灰質和白質)，以濾紙吸去表面液體，在5 min之內用分析天平稱量左右腦組織濕重。之后將其放入52℃的醫用電烤箱72 h，再分別稱量腦組織干重(2次測量之差小于0.2 mg)。按Elliott公式計算腦組織含水量，腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.4 RT-PCR檢測MMP-9 mRNA的表達 在各個時間點，大鼠斷頭取腦，在生理鹽水冰面上迅速取凍傷灶周圍(距凍傷灶3 mm內的半球前1/2右部分)腦組織，置入液氮中保存待用。取凍傷灶周圍組織50 mg,按RNAex Reagent 說明書提取總RNA。按試劑盒說明書進行cDNA第一鏈的合成(逆轉錄，RT)，然后進行PCR擴增。 PCR引物由上海博亞生物技術有限公司設計合成。MMP-9引物序列：上游引物：5’-ACTTTGTAGGGTCGGTTCTG3’下游引物：5’-CCTAATGCCCAGTAGAGAGC-3’，PCR產物344 bp。內參照GAPDH引物序列：上游引物：5’-CTTCACCACCATGGAGAAGGC-3’,下游引物：5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’，PCR產物237 bp。MMP9引物濃度為10 pmol/μl,內參照GAPDH引物濃度為50 pmol/μl。

反應總體系為20 μl,5×PCR Buffer 5 μl,TaKaRa Ex TaqTMHS 0.125 μl,上游特異性PCR引物1.0 μl,下游特異性PCR引物1.0 μl,內參照GAPDH上游引物0.2 μl,內參照下游引物0.2 μl，cDNA 2 μl,加滅菌超純水至20 μl。MMP-9擴增程序：94℃ 2 min 1次，94℃ 30 s，55.5℃ 30 s，72℃ 1 min，30循環；72℃ 5 min終末延伸。

PCR產物分析：將PCR產物在1.8%瓊脂糖凝膠上電泳，樣品加樣量均為6 μl(PCR產物5 μl+loading buffer 1 μl),在0.5×TBE中100V電泳40 min，經凝膠成象儀處理成像，將圖像輸入圖像分析軟件系統(Quantity One-4.4.0,BIO-RAD)，計算出PCR產物密度含量，用目的基因擴增量與內參照基因擴增量的比值來表示所要檢測基因的相對表達量。基因的相對表達量=目的基因光密度值/內參照基因光密度值×100%。

1.5 免疫組化技術檢測MMP-9蛋白水平的表達 冷凍傷后各相應時相點大鼠經1%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)深麻醉，剪開胸前臂，暴露心臟，經左室插入靜脈針頭直達主動脈，快速灌注肝素生理鹽水，剪開右心耳放血，待流出液體清亮后(約需0.9%氯化鈉溶液200 ml)，再以4%多聚甲醛溶液灌注45 min，約300 ml固定。迅即斷頭取腦，以凍傷灶為中心切取冠狀腦組織塊，4%多聚甲醛溶液4℃固定24 h,常規石蠟包埋。使用時將石蠟包埋的腦組織連續冠狀切片(厚5 μm)，隔5取1，參照SABC試劑盒說明行MMP-9免疫組化檢測。陰性對照片用PBS代替一抗，陽性對照用試劑盒內附陽性對照片。

鏡下觀察胞漿有棕黃色顆粒者為陽性細胞。采用醫學圖像分析軟件(Leica Qwin，德國)，進行分析。每組隨機選擇6張免疫組化染色片(免疫組化染色強度大致一致)，每張切片隨機選取6個高倍視野，用圖像分析軟件對染色結果進行灰度分析，以平均灰度值代表蛋白表達水平：蛋白表達強則灰度值低，反之則高。

2 結果

2.1 腦組織含水量的測定結果 在傷后2、6、24 h，傷后0.9%氯化鈉溶液治療組傷側腦組織含水量均高于假手術組，差異有統計學意義(P<0.01)，24 h最高；在傷后6、24 h，傷后異丙酚治療組腦組織含水量與傷后0.9氯化鈉溶液治療組比較均顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05或<0.01)。見表1。

表1腦組織含水量

組別腦組織含水量假手術組78.06±0.53傷后0.9%氯化鈉溶液治療組 2h79.04±0.58# 6h80.12±0.71# 24h81.19±0.90#傷后異丙酚治療組 2h78.79±0.53* 6h79.24±0.52#△ 24h80.05±0.82☆

注：與假手術組比較，*P<0.05,#P<0.01;與傷后0.9%氯化鈉溶液組比較，△P<0.05，☆P<0.01

2.2 腦組織MMP-9 mRNA的表達 經紫外分光光度計測定提取的總RNAOD260 /OD280的值為1.7～2.0，說明提取的總RNA純度良好。利用選定的逆轉錄條件和設定的二對引物對49份標本進行檢測，分別得到MMP-9 344 bp和GAPDH 237 bp的擴增產物。內參照GAPDH在237 bp處亮度均衡，在各反應系中擴增結果基本一致，證實PCR反應基本真實地反應了MMP-9mRNA在腦組織中的表達。

3組光密度的比值結果，假手術組腦組織MMP-9 mRNA水平表達很低，腦冷凍傷后2 h,0.9%氯化鈉溶液組MMP-9 mRNA 水平較假手術組明顯升高，6 h最高，24 h仍保持在較高水平(P<0.01)；在傷后6 h及24 h，傷后異丙酚治療組腦組織MMP-9 mRNA水平與0.9%氯化鈉溶液組比較均降低，差異有統計學意義(P<0.01)。見表2、圖1。

表2傷側腦組織MMP-9mRNA表達

組別MMP-9假手術組0.28±0.04傷后0.9%氯化鈉溶液治療組 2h0.73±0.13* 6h0.99±0.09* 24h0.86±0.12*傷后異丙酚治療組 2h0.65±0.11* 6h0.80±0.15*# 24h0.64±0.09*#

注：與假手術組比較，*P<0.01;與傷后0.9%氯化鈉溶液組比較，#P<0.01

圖1 腦冷凍傷后3組MMP-9 mRNA表達情況

2.3 MMP-9蛋白表達結果 假手術組腦組織MMP-9蛋白未見明顯陽性表達，腦冷凍傷后2 h,0.9%氯化鈉溶液組MMP-9蛋白陽性表達水平(蛋白表達強則灰度值低，反之則高)較假手術組明顯升高，6 h最高，24 h仍保持在較高水平(P<0.01)；陽性細胞的主要來源于凍傷灶周圍的神經元、膠質細胞、微血管內皮細胞，凍傷中心區無表達。在傷后6 h及24 h，傷后異丙酚治療組腦組織MMP-9蛋白表達水平與0.9%氯化鈉溶液組比較均顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05或0.01)。見表3、圖2～7。

表3傷側腦組織MMP-9蛋白表達灰度值

組別MMP-9灰度值假手術組243.93±4.65傷后0.9%氯化鈉溶液治療組 2h156.45±4.14* 6h145.04±4.04* 24h152.25±4.40*傷后異丙酚治療組 2h158.90±3.35* 6h151.77±5.09*# 24h158.85±2.83*△

注：與假手術組比較，*P<0.01;與傷后0.9%氯化鈉溶液組比較，#P<0.05，△P< 0.01

圖2 假手術組腦組織MMP-9(免疫組化×400) 圖3 腦冷凍傷后2 h 0.9%氯化鈉溶液組MMP-9(免疫組化×400)

3 討論

創傷性腦水腫是一種混合性腦水腫，其病理生理機制一直處于探索之中[6]。其中血腦屏障受損及血管源性腦水腫的發生機制更是備受關注。顱腦損傷時,血腦屏障受損,使其在形態和功能兩方面都發生改變,通透性改變是血腦屏障功能障礙的最重要表現。血腦屏障破壞后血液中毒性物質進入腦內,離子平衡失調引起腦水腫,可導致顱內壓升高引起腦疝,往往是病人死亡的主要原因。緊密連接的開放、小泡轉運的增強、內皮細胞的損傷、基底膜的破壞及星形神經膠質細胞的損傷都可引起BBB通透性增加，導致血管源性腦水腫。

圖4 腦冷凍傷后6 h傷后0.9%氯化鈉溶液組MMP-9(免疫組化×400) 圖5 腦冷凍傷后24 h傷后0.9%氯化鈉溶液組MMP-9(免疫組化×400)

圖6 腦冷凍傷后6 h傷后異丙酚治療組MMP-9(免疫組化×400) 圖7 腦冷凍傷后24 h傷后異丙酚治療組MMP-9(免疫組化×400)

近期，基質金屬蛋白酶(MMPs)在血管源性腦水腫的研究中受到廣泛關注。MMPs是一組降解細胞外基質蛋白的鋅依賴蛋白酶，其表達和活性的升高可引起BBB通透性增加。研究顯示MMPs主要是MMP-9在顱腦損傷后表達增高，參與BBB的破壞及繼發性腦損害[3，4]。在腦冷凍傷模型，使用基質金屬蛋白酶非特異性抑制劑MMI270，可明顯減輕血腦屏障的通透性、腦水腫及繼發性損害[7]。在本實驗中，我們應用RT-PCR技術從基因水平考察MMP-9的表達，應用免疫組化從蛋白水平考察MMP-9的表達。實驗結果顯示,腦冷凍傷后2 h腦組織MMP-9表達顯著升高，24 h仍保持在較高水平。與Morita-Fujimura等[8]應用酶譜法測定了小鼠冷凍傷模型MMP-9蛋白的表達情況相似。MMP-9陽性表達主要見于凍傷灶周圍神經元、膠質細胞、血管內皮細胞、中性粒細胞等，凍傷中心壞死區無表達。與文獻報道關于MMP-9陽性細胞分布[9]基本一致，說明凍傷灶周圍殘存的神經元、膠質細胞等被激活，表達并分泌MMP-9，介導血腦屏障基底膜及神經組織的損傷。至于腦凍傷后涉及MMP-9活性表達的機制還不清楚。Morita-Fujimura等[8]研究顯示冷凍傷后活性氧的生成可促使MMP-9誘導并激活，進而加重內皮細胞的損傷和血管源性腦水腫的發展。應用SOD1轉基因技術或基因敲除技術在其他的腦損傷模型也證實了活性氧可誘導并激活MMP-9，進而破壞BBB。由此可見，活性氧自由基不僅直接損害內皮細胞，還可以通過誘導并激活MMP-9，降解ECM，致使BBB完整性被破壞。MMP-9基因啟動子區具有AP-1(激動劑激活蛋白)的結合位點，腦冷凍傷時AP-1結合活性的增高可誘導MMP-9的表達，某些及早基因c-fos和c-jun可作用于AP-1結合位點。腦損傷后活性氧生成誘導了c-fos和c-jun的表達，后者激活了MMP-9的AP-1區，致使MMP-9表達增加。結合以往的資料，我們認為腦冷凍傷后MMP-9的誘導及激活是BBB損壞、血管源性腦水腫形成發展的重要機制之一。

在傷后6 h及24 h，傷后異丙酚治療組腦組織MMP-9 mRNA及蛋白表達水平與0.9%氯化鈉溶液組比較均顯著降低。提示異丙酚具有抑制MMP-9基因表達的作用。而且與對腦水的影響基本平行，說明異丙酚可能通過抑制MMP-9基因表達來發揮對腦損傷后BBB的保護作用，減輕創傷后腦水腫。研究表明，異丙酚可抑制癌癥患者MMP-9的表達[10]，可抑制腦缺血再灌注時腦組織MMP-9的表達上調來發揮腦保護作用[2]。在腦損傷時，增高的ROS可誘導MMP-9的轉錄與表達，異丙酚具有抗過氧化損傷的作用[11]，異丙酚可能通過清除ROS 來介導對MMP-9的抑制作用。但具體的機制還需要進一步研究。

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EffectofpropofolonneuronalMMP-9expressionafterbraininjuryinrats

SUNZhengqing,GAIChenglin,SUFang,etal.DepartmentofAnesthesiology,No.230HospitalofPLA,Heilongjiang,Dandong118000,China

ObjectiveTo observe the effect of propofol on neuronal MMP-9 expression after brain injury in rats and to explore its action mechanisms in neuroprotective effects.MethodsNinety-one health male Wistar rats were randomly divided into sham-operation group,saline group(saline treatment after brain injury),propofol group(propofol treatment after brain injury).Propofol dose was clinical anesthesia relevant dose(100mg/kg),which was injected intraperitoneally 15 min after brain frostbite,once every 2 hours.The brain frostbite models were established by skull external intelligence frostbite method,then the brain tissues were collected at 2,6,24 hours after frostbite.The brain water content was detected by dry wet weight method;the expression levels of MMP-9 mRNA were detected by RT-PCR;expression levels of MMP-9 protein were detected by immunohistochemistry.ResultsThe brain water content in saline group in different time points was significantly higher than that in sham-operation group(P<0.01),which peaked at 24 hours after brain frostbite.The brain water content in propofol group was significantly lower than that in saline group at 6,24 hours after brain frostbite(P<0.05 orP<0.01).The expression levels of MMP-9 mRNA in sham-operation group were decreased,however,which in saline group were significantly increased at 2 hours after brain frostbite,as compared with those in sham-operation(P<0.01),which peaked at 6 hours,continued at 24 hours(P<0.01).The expression levels of MMP-9 mRNA in propofol group were significantly decreased at 6,24 hours after brain frostbite,as compared with those in saline group(P<0.05 orP<0.01).The expression levels of MMP-9 protein in saline group were significantly increased at 2 hours after brain frostbite,as compared with those in sham-operation group,which peaked at 6 hours,continued at 24 hours(P<0.01).The expression levels of MMP-9 protein in propofol group were significantly decreased at 6h,24h after brain frostbite,as compared with those in saline group(P<0.05 orP<0.01).ConclusionPropofol at clinical anesthesia relevant dose can relieve brain edema after brain injury,which may be correlated to the inhibitory effect of propofol on expression of MMP-9.

propofol;traumatic brain injury;MMP-9;brain edema

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.16.001

118000 遼寧省丹東市，中國人民解放軍第230醫院麻醉科(孫正清、蓋成林、蘇芳)；第三軍醫大學附屬新橋醫院麻醉科(楊天德)

楊天德，400038 第三軍醫大學附屬新橋醫院麻醉科;

E-mail:31011@ sina.com

R 614

A

1002-7386(2014)16-2405-05

2014-04-02)