分光光度法測定云芝發酵浸膏中總三萜含量

李雨婷+李萌+金周雨+吳雷+宋慧

摘要采用分光光度法對云芝發酵浸膏中總三萜化合物含量進行測定。結果表明：5%香草醛-冰醋酸用量為0.3 mL，高氯酸用量為0.8 mL，反應溫度為70℃，反應時間為20 min，加冰醋酸5 mL，搖勻，在570 nm處測定其吸光值，效果最佳。標準曲線方程為Y=0.0092x-0.0447，R2=0.9991，吸光值與齊墩果酸含量在13 μg～91 μg范圍內呈良好的線性關系；三萜類化合物的質量分數為0.564%，RSD=0.7%。齊墩果酸加樣回收率98.60%～101.88%，平均加樣回收率為99.93%，RSD為1.12%；在反應結束0～40 min內，吸光值相對穩定。該方法具有簡便、快速、靈敏、重復性好。

關鍵詞云芝發酵浸膏；總三萜化合物；分光光度法

中圖分類號：O657.3 文獻標識碼：A 文章編號：1671-7597（2014）11-0092-02

云芝為多孔菌科云芝屬，是腐生真菌，生于多種闊葉樹木樁、倒木和枝上。世界各地森林中均有分布[1]。云芝含有多種活性物質，其含有的三萜類化合物具有抗炎、保肝、止痛[2]等功能，還具有顯著的抗腫瘤和促進免疫、降低血壓作用[3]，在功能性食品的應用上具有一定的前景。但有關云芝發酵浸膏中的三萜類化合物含量卻少有報道。本文參照目前廣泛使用的三萜類化合物測定的方法[4-6]，對采用乙醇浸泡的常規方法提取云芝發酵浸膏中的三萜類化合物進行含量測定，以期為云芝發酵浸膏中的三萜類化合物的開發和利用提供依據。并旨在為云芝的進一步開發和綜合利用提供科學參考。

1材料與方法

1.1 材料與試劑

齊墩果酸標準品購于成都曼思特生物有限責任公司，冰醋酸、高氯酸、香草醛、乙醇、甲醇均為分析純。

1.2 儀器與設備

7530G紫外分光光度計（上海分析儀器廠）；

HH-2數顯恒溫水浴鍋、（金壇市富華儀器有限公司）；

SHB-B95型循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 試劑的配置

1）香草醛-冰醋酸的配制：精密稱取0.5 g香草醛，加入10 mL冰醋酸，即得5%香草醛-冰醋酸溶液。

2）供試樣品溶液的制備：室溫下，精密稱取云芝發酵浸膏10 g，3倍體積95%乙醇浸泡24小時（不斷攪拌），取上清液，三次重復，合并提取液，過濾濃縮，95%乙醇定容至100 mL，搖勻備用。

3）標準品溶液的制備：精密稱取齊墩果酸標準品13 mg，定容于100 mL甲醇中，即得齊墩果酸標準品溶液的濃度為130 μg/mL。

1.3.2 測定條件的選擇

選擇不同的波長、香草醛用量、高氯酸用量、反應溫度和時間，分別測定吸光值，用于選擇最佳的比色條件。

1）波長的選擇：準確稱取齊墩果酸標準品溶液0.2 mL于具塞試管中，水浴加熱揮去溶劑，加入0.2 mL 5%的香草醛-冰醋酸溶液，0.8 mL的高氯酸溶液，密封，于70℃水浴加熱20 min，取出后迅速冷水冷卻，加5 mL冰醋酸，搖勻，對顯色體系在200 nm-600 nm波長下掃描，結果表明：在570 nm處有最大吸收，且空白無干擾，故選擇570 nm為測定波長。

2）香草醛-冰醋酸用量的選擇：精確稱取標準品溶液0.2 mL于具塞試管中，水浴加熱揮去溶劑，加新鮮配制的5%的香草醛-冰醋酸0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL，高氯酸0.8 mL，密封。于70℃水浴加熱20 min，取出后迅速冷水冷卻，加5 mL冰醋酸，搖勻，在570 nm處測定其吸光值。

結果得出看出，香草醛-冰醋酸的用量在0.3 mL時，吸光值較大，繼續增加香草醛-冰醋酸的用量對吸光值的影響不大，故選擇香草醛-冰醋酸的用量為0.3 mL。

3）高氯酸用量的選擇：精確吸取標準品溶液0.2 mL于具塞試管中，水浴加熱揮去溶劑，加新鮮配制的5%的香草醛-冰醋酸0.3 mL，高氯酸分別為0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，密封。于70℃水浴加熱20 min，取出后迅速冷水冷卻，加5 mL冰醋酸，搖勻，在570 nm處測定其吸光值。

結果得出，高氯酸用量在0.8 mL時，吸光值最大，繼續增加高氯酸用量對吸光值的影響不大，故選擇高氯酸的用量為0.8 mL。

4）反應時間的選擇：精確稱取標準品溶液0.2 mL于具塞試管中，在上述實驗的基礎上，改變反應時間（min），分別測定其吸光值。

結果得出在15 min～25 min內，吸光值比較穩定，故選擇20 min為反應時間。

5）反應溫度的選擇：精確稱取標準品溶液0.2 mL于具塞試管中，在上述實驗的基礎上，改變反應溫度（℃），分別測定其吸光值。

結果得出，溫度在60℃～80℃范圍內相對穩定，故選擇70℃為反應溫度。

1.3.3 標準曲線的制作

準確吸取齊墩果酸標準品溶液0.0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL于八支具塞試管中，水浴加熱揮去溶劑。按上述優選條件及步驟在570 nm波長下測定吸光值。以吸光度A為縱坐標，齊墩果酸質量（μg）為橫坐標，制作標準曲線。得回歸方程為：Y=0.0092x-0.0447，R2=0.9991。表示吸光值與齊墩果酸含量在13 μg～91 μg范圍內呈良好的線性關系。

2結果與分析

2.1 加樣回收率

精確吸取齊墩果酸標品0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL于具塞試管中，按標準曲線方法操作，測定吸光值，計算含量，并計算回收率和RSD。

結果為：齊墩果酸加樣回收率98.60%～101.88%，平均加樣回收率為99.93%，RSD為1.12%，均符合數學統計，表明本法能滿足對樣品三萜類化合物含量的測定，且測定結果準確可靠。

2.2 穩定性實驗

將樣品溶液按標準曲線繪制的各點分別在0～60 min內進行測定，在反應結束0～40 min內，吸光值相對穩定，所以應該在顯色后40 min內進行測定。

2.3 精密度實驗

準確吸取標樣品溶液0.2 mL于具塞試管中，按標準曲線方法操作，五次重復。按制備標準曲線項下操作，測得吸收值并計算含量，經計算RSD為1.79%，以齊墩果酸測定云芝發酵浸膏中總三萜含量具有良好的重現性，表明儀器精密度良好。

2.4 樣品含量測定

準確吸取待測樣品0.1 mL于具塞試管中，共做5次重復，按標準曲線方法操作，測定其中三萜含量。結果為：云芝中的三萜類化合物的質量分數為0.564%，RSD為0.7%。

3結論與討論

1）本實驗采用分光光度法，以齊墩果酸為標準品，用5%香草醛-冰醋酸、高氯酸為顯色劑，在波長570 nm處用分光光度法首次測定了云芝發酵浸膏中總三萜類化合物的含量。最佳反應條件：5%香草醛-冰醋酸0.3 mL，高氯酸0.8 mL，反應溫度為70℃，反應時間為20 min，加冰醋酸5 mL，搖勻，在570 nm處測定其吸光值得標準曲線方程為Y=0.0092x-0.0447，R2=0.9991，標準曲線在13 μg～91 μg范圍內呈良好的線性關系，加樣回收率98.60%～101.88%，平均加樣回收率為99.93%，RSD為1.12%，精密度實驗RSD為1.79%，測定過程中樣品顯色后在0～40 min吸光值相對穩定，精密度、加樣回收率試驗結果表明該法簡便可靠、結果穩定、重現性好。

2）該法簡便、快速、靈敏、測定結果穩定，重現性好，且對儀器要求不高，實際可行，適合云芝發酵浸膏中三萜類化合物的含量測定。

參考文獻

[1]林志彬.靈芝的現代研究[M].北京：北京醫科大學出版社，2001．

[2]王明宇，劉強，車慶明，等.靈芝三萜類化合物對3種小鼠肝損傷模型的影響[J].藥學學報，2000，35（5）：326-329.

[3]曾祥麗，包海鷹，等.靈芝三萜類成分及藥理學研究進展[J].菌物究，2004，2（1）：68-77.

[4]王文祥，顧振綸.比色法測定山楂總三萜酸的含量[J].中國野生植物資源，2001，20（5）：47-48.

[5]帕里達，堵年生，等.比色法測定瑣瑣葡萄中總三萜類成分的含量[J].華西藥學雜志，2002，17（6）：475.

[6]姚松君，黃生權，陳壯耀，等.超聲輔助提取靈芝三萜的工藝研究[J].現代食品科技，2009，25（10）：1120-1223.

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