柚皮素通過調控p38MAPK通路保護心肌細胞H9c2對抗阿霉素引起的毒性反應

馬福義 楊迎春 黃擎軒 趙利

·論著·

柚皮素通過調控p38MAPK通路保護心肌細胞H9c2對抗阿霉素引起的毒性反應

馬福義 楊迎春 黃擎軒 趙利

目的探討柚皮素(naringenin，NAR)能否通過調控p38絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路保護心肌細胞H9c2對抗阿霉素(doxorubicin,DOX)引起的毒性反應。方法應用5 μmol/L DOX處理心肌細胞H9c2建立DOX心肌毒性損傷模型;CCK-8比色法檢測細胞H9c2存活率；Western blot法測定p38MAPK蛋白表達水平;雙氯熒光素染色熒光顯微鏡照相檢測細胞內活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。結果在5 μmol/L1 DOX處理H9c2心肌細胞前，應用40 μmol/L NAR預處理24 h或應用5 μmol/L SB203580預處理60 min均能明顯抑制DOX引起的心肌細胞毒性，使細胞H9c2存活率升高，細胞內ROS水平明顯降低，并能抑制5 μmol/L DOX對磷酸化(p)p38MAPK表達的上調作用。結論柚皮素通過抑制p38MAPK通路保護H9c2心肌細胞對抗DOX引起的細胞毒性。

柚皮素；阿霉素；心肌毒性；p38MAPK；心肌細胞

柚皮素(naringenin,NAR)是柚皮甙的甙元，是一類天然黃酮類化合物，屬二氫黃酮類化合物，廣泛存在于枳實、化橘紅、桃葉[1-3]等天然植物中，具有抗菌、抗炎、清除自由基、抗氧化、止咳祛痰、降血脂、抗癌抗腫瘤、解痙和利膽、預防和治療肝病、抑制血小板凝結、抗粥樣動脈硬化等[4-7]作用，可被廣泛地應用于醫藥、食品等領域。近年，NAR的心臟保護作用日益受到重視。值得注意的是，NAR能減輕抗癌藥阿霉素(doxorubicin，DOX)引起的心肌毒性[8]。但是，NAR保護心肌細胞對抗阿霉素毒性引起的心臟毒性機制還不明確，其能否通過調控p38絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路保護心肌細胞對抗DOX引起的心肌毒性筆者尚未見報道。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)是哺乳動物細胞內廣泛存在的一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，其主要的家族成員有三種，分別為細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated protein kinases 1/2,ERK1/2)、C-Jun N端激酶(C-Jun N-terminal kinase,JNK)和p38MAPK，參與細胞增殖、分化、轉化、凋亡的調節，并與炎癥及其他多種疾病的發生機發展機制密切相關。其中p38MAPK作為細胞內重要的信號通路-MAPK家族中的一個成員，主要被細胞應激(比如紫外線、熱休克等)激活[9]，主要參與應激條件下細胞的炎性反應和細胞凋亡過程。有報道指出，p38MAPK介導DOX引起心肌細胞毒性[10]。而NRG具有抑制MAPK活性的作用[11]。所以，我們推測NAR可通過調控p38MAPK通路對抗DOX引起的心肌細胞炎性反應。本文應用心肌細胞建立DOX引起炎癥的細胞模型，探討NAR是否能通過調控p38MAPK通路保護心肌細胞對抗DOX引起的毒性反應。

1 材料與方法

1.1 材料 Naringenin、阿霉素、SB203580、DCFH-DA購自Sigma Aldrich公司(USA)。細胞計數試劑盒8(cell counter kit-8,CCK-8)購自Dojindo Lab(日本)。DMEM-F12 培養基以及特級胎牛血清(FBS)購自Gibco BRL(USA)?？筽38、p-p38抗體購自Cell Signaling technology Inc (CST)。H9c2心肌細胞購自上海撫生實業有限公司。

1.2 細胞培養和與處理方法 H9c2心肌細胞來源于大鼠胚胎期心臟組織，在37℃、5% CO2的條件下，培養于含10%胎牛血清的DMEM-F12培養基。實驗分為6組：(1)正常對照組；(2)DOX損傷組：5 μmol/L DOX 作用24 h；(3)NAR預處理+DOX損傷組：40 μmol/L NAR 作用H9c2心肌細胞24 h，撤去，用PBS洗兩次，接著5 μmol/L DOX 作用24 h；(4)SB203580預處理+DOX損傷組：3 μmol/L SB203580作用H9c2心肌細胞60 min，撤去，用PBS洗2次，接著5 μmol/L DOX 作用24 h；(5)NAR組：40 μmol/L NAR 作用H9c2心肌細胞24 h；(6)SB203580組：3 μmol/L SB203580作用H9c2心肌細胞60 min。

1.3 CCK-8測定細胞存活率 H9c2 心肌細胞接種于96孔培養板中，當細胞生長到培養孔面積大約80%時，根據實驗需要進行不同的處理：(1)分別給予10、20、40、80 μmol/L不同濃度的NAR預處理24 h后撤去，PBS洗2次，再用5 μmol/L阿霉素培養24 h；(2)NAR預處理的不同時間(6、12、24、36和72 h)后撤去，PBS洗2次，再用5 μmol/L阿霉素培養24 h；每個處理因素設5個復孔。終止培養后，每孔加入10 μl CCK-8，輕搖，37 ℃孵育1.5 h，用酶標儀(λ=450 nm)記錄各孔的吸光度(OD)。取5孔OD值的平均數，按下列公式計算細胞存活率：細胞存活率(%)= 處理組OD/對照組OD×100%，重復3次。

1.4 細胞內ROS含量的檢測 H9c2心肌細胞接種于24孔培養板中，當細胞生長到培養孔面積約80%時，上述各實驗組的不同處理因素完成后，PBS沖洗2次，用10 μmol/L DCFH-DA染液于37℃孵育30 min。在熒光顯微鏡下隨機選取5個不重復區攝片，用ImageJ 1.41軟件分析5個視野綠色熒光強度的平均值，再對每組的各樣本進行統計分析

1.5 Western blot測定p38蛋白的表達 H9c2心肌細胞接種于60 mm培養皿中，各實驗組給予不同的處理因素后，用預冷的PBS洗兩次，加入細胞裂解液，4℃靜置30 min，12000 r/min離心10 min，取上清，采用BCA法進行蛋白定量?？偟鞍捉汼DSPAGE分離后，轉移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉60 min，隨后加入抗p38、p-p38抗體 (1∶1000)，4℃過夜，用TBST洗3次，10 min/次。將PVDF膜用發光試劑ECL顯色，暗室曝光到X線片上，凝膠成像系統掃描分析結果。

2 結果

2.1 NAR抑制DOX引起的心肌細胞毒性 5 μmol/L DOX處理H9c2心肌細胞24 h可引起明顯的細胞毒性，使細胞存活率降低，與正常對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。在5 μmol/L DOX作用心肌細胞前，分別應用10、20、40、和 80 μmol/L柚皮苷(NRG)預處理24 h均可抑制DOX引起的細胞毒性，使細胞存活率升高(P<0.01),其中40 μmol/L NAR的保護作用最大。因此，本研究再觀察40 μmol/L NAR在不同的預處理時間(6、12、24、36和72 h)的心肌細胞保護作用。40 μmol/L NAR可產生明顯的抗細胞毒性作用，預處理24 h的作用最大。根據上述兩項實驗結果，本研究選用40 μmol/L NAR和24 h作為后續實驗的有效保護濃度及有效預處理時間。見圖1、2。

圖1 不同濃度的NAR抑制DOX引起的心肌細胞毒性

圖2 不同時間的NAR抑制DOX引起的心肌細胞毒性

2.2 NAR和p38MAPK抑制劑抑制DOX引起的心肌細胞毒性 40 μmol/L NAR 預處理細胞24 h或5 μmol/L SB203580 預處理細胞60 min可抑制DOX引起的細胞毒性，使細胞存活率升高。而單獨40 μmol/L NAR 預處理細胞24 h或5 μmol/L SB203580 預處理細胞60 min不產生細胞毒性，表現為細胞存活率與對照組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 NAR和p38MAPK抑制劑抑制DOX引起的心肌細胞毒性

2.3 NAR和p38MAPK抑制劑抑制DOX對磷酸化p38MAPK表達的上調作用 正常的H9c2心肌細胞具有一定水平的磷酸化(phosphorylated，p)p38MAPK蛋白表達。5 μmol/L DOX作用H9c2細胞60 min可使p-p38MAPK表達水平明顯升高，與正常對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。但是，5 μmol/L DOX對總(t)p38MAPK蛋白表達無明顯影響。在5 μmol/L DOX處理H9c2心肌細胞前，應用40 μmol/L NAR預處理24 h可明顯地抑制DOX對p-p38MAPK表達的上調作用(P<0.01)。40 μmol/L NAR本身對p-p38MAPK的基礎表達無明顯影響。5 μmol/L p38MAPK抑制劑抑制抑制 SB203580 預處理細胞60 min也和NAR一樣能抑制DOX對磷酸化p38MAPK表達的上調作用。見圖4、5。

圖4 NAR抑制DOX對磷酸化p38MAPK表達的上調作用

圖5 p38MAPK抑制劑抑制DOX對磷酸化p38MAPK表達的上調作用

2.4 NAR和p38MAPK抑制劑抑制DOX引起的心肌細胞氧化應激 為了探討NAR、p38MAPK通路在HG引起的氧化應激反應中的作用，本研究在DOX作用H9c2心肌細胞前，應用p38MAPK抑制劑處理60 min，觀察對HG誘導ROS生成的影響。圖6顯示，應用5 μmol/L DOX處理H9c2心肌細胞24 h，可明顯地增加ROS生成，與正常對照組比較，差異具有統計學意義(P<0.01)。在DOX處理心肌細胞前，分別應用3 μmol/L SB203580(p38MAPK抑制劑)或40 μmol/L NAR預處理能顯著阻斷DOX對ROS生成的促進作用，與HG處理組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。上述結果提示，NAR和p38MAPK抑制劑抑制DOX引起的心肌細胞氧化應激。見圖6。

圖6 NAR和p38MAPK抑制劑抑制DOX引起的心肌細胞氧化應激

3 討論

DOX是一種蒽環類抗生素(anthracycline antibiotic)，臨床上廣泛用于抗惡性腫瘤比如白血病、淋巴瘤、乳腺癌等的廣譜化療藥物。但是，由于它能引起心肌毒性[12]，故限制其在臨床上的應用。研究證實，DOX誘發心肌毒性的機制是多方面的，其中氧化應激此外，鈣離子平衡失調、細胞線粒體損傷、細胞凋亡、腎上腺功能失調被認為是一個重要的致病機制[13-15]。此外，心肌炎癥與DOX心肌毒性也密切相關。本研究也觀察到，DOX能引起H9c2心肌細胞產生氧化應激反應，表現為細胞內ROS水平升高。另方面，本研究證實，DOX能激活H9c2心肌細胞內p38MAPK通路；p38MAPK抑制劑(SB203580)能抑制細胞內ROS的生成，提示p38MAPK通路可能介導DOX引起的心肌細胞應激反應。

重要的是，本研究證實，NAR不僅抑制DOX激活的p38MAPK通路，同時也能控制DOX引起的應激反應和細胞毒性，表現為H9c2心肌細胞存在活率升高，使細胞內ROS明顯降低，因此提示通過抑制p38MAPK通路可能是NAR保護心肌細胞對抗DOX誘發的細胞毒性和應激反應的重要機制之一。由于活性氧(ROS)能激活p38MAPK通路，而NRG具有消除ROS的作用，因此，NAR是否通過抑制DOX引起的ROS水平升高繼而抑制p38MAPK通路尚需今后進一步探討。

綜上所述，本文證實NAR可通過抑制p38MAPK通路保護H9c2心肌細胞對抗DOX誘發的應激反應及細胞毒性，這為深入闡明NAR的心肌保護作用，特別是對抗DOX心肌毒性的作用機制提供了新的資料。

1 劉海興.毛細管區帶電泳法測定中藥枳實中柚皮素的含量.煙臺大學學報(自然科學與工程版)，2008，21：310-312.

2 李江.反相高效液相色譜法測定化橘紅中柚皮苷和柚皮素含量.實用臨床醫學雜志，2009，13：74.

3 陳雪峰，班黎黎，吳麗萍.有機溶劑提取桃葉中柚皮素的工藝研究.食品科技，2009，34:209-212.

4 Renugadevi J,Prabu SM.Cadmium-induced hepatotoxicity in rats and the protective effect of naringenin.Exp Toxicol Pathol，2010,62:171-181.

5 Sabarinathan D,Mahalakshmi P,Vanisree AJ.Naringenin,a flavanone inhibits the proliferation of cerebrally implanted C6 glioma cells in rats.Chem Biol Interact,2011,189:26-36.

6 Ekambaram G,Rajendran P,Magesh V,et al.Naringenin reduces tumor size and weight lost in N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine-induced gastric carcinogenesis in rats.Nutr Res,2008,28:106-112.

7 Qin L,Jin L,Lu L,et al.Naringenin reduces lung metastasis in a breast cancer resection model.Protein Cell,2011,2:507-516.

8 Arafa HM,Abd-Ellah MF,Hafez HF.Abatement by naringenin of doxorubicin-induced cardiac toxicity in rats.Egypt Natl Canc Inst,2005,17:291-300.

9 Ono K,Han J.The p38 signal transduction pathway:activation and function.Cell Signal，2000,12:1-13.

10 Kang YJ,Zhou ZX,Wang GW,et al.Suppression by metallothionein of doxorubicin-induced cardiomyocyte apoptosis through inhibition of p38 mitogen-activated protein kinases.Biol Chem,2000,275:13690-13698.

11 Nie YC,Wu H,Li PB,et al.Naringin attenuates EGF-induced MUC5AC secretion in A549 cells by suppressing the cooperative activities of MAPKs-AP-1 and IKKs-IκB-NF-κB signaling pathways.Eur J Pharmacol，2012,690:207-213.

12 Scully RE,Lipshultz SE.Anthracycline cardiotoxicity in long-term survivors of childhood cancer.Cardiovasc Toxicol,2007,7:122-128.

13 Menna P,Salvatorelli E,Minotti G.Cardiotoxicity of antitumor drugs.Chem Res Toxicol,2008,21:978-989.

14 Iarussi D,Indolfi P,Casale F,et al.Recent advances in the prevention of anthracycline cardiotoxicvity in childhood.Curr Mec Chem,2001,8:1649-1660.

15 Takemura G,Fujiwara H.Doxorubicin-induced cardiomyopathy from the cardiotoxic mechanisms to management.Prog Cardiovase Dis,2007,49:330-352.

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.15.010

074000 河北省高碑店市醫院(馬福義、楊迎春)；廣東省化州市人民醫院(黃擎軒)；福建省人民醫院(趙利)

R 329.2+5

A

1002-7386(2014)15-2268-04

2014-01-10)