蛛網膜下腔出血后遲發性腦血管痙攣中TNF-α和NF-кB的表達變化

劉穎 劉業松 李聰慧 葉建婭

·論著·

蛛網膜下腔出血后遲發性腦血管痙攣中TNF-α和NF-кB的表達變化

劉穎 劉業松 李聰慧 葉建婭

目的檢測蛛網膜下腔出血(以下簡稱SAH)后遲發性腦血管痙攣中TNF-α和NF-кB的表達變化。方法56只中國白兔隨機分成3組：對照組(n=8)：不做枕大池穿刺注血，處死；SAH組(n=24)：在第0天和第2天分二次枕大池注射自體動脈血，分別在第1次注血后第4天、第7天和第14天分三批處死，每組8只；假手術組(n=24)：只做枕大池穿刺不注血，第4天、第7天和第14天處死，每組8只。通過計算動脈口徑比判斷基底動脈痙攣程度，使用免疫組化和免疫蛋白印跡的方法檢測遲發性腦血管痙攣中TNF-α和NF-кB的表達變化。結果枕大池注血方法可以造成SAH后遲發性腦血管痙攣模型。NF-κB 和 TNF-α在注血后第4天表達開始增加(P<0.01)，在第7天達到最高值(P<0.01)，第14天降到對照組水平。結論蛛網膜下腔出血后遲發性腦血管痙攣中NF-κB及 TNF-α表達增加，炎癥反應在此過程中起著重要作用。

遲發性腦血管痙攣；炎癥；腫瘤壞死因子-α；核因子-κB

遲發性腦血管痙攣(DCVS)，開始于出血48 h后，在7～10 d左右達到高峰，可持續2周或更長[1]，目前機制尚未明了。DCVS不同于急性期腦血管痙攣，一旦發生，往往難于逆轉[2]?？稍斐蓢乐氐哪X缺血和腦損傷，是引起蛛網膜下腔出血(SAH)后致死或致殘的主要原因。各種文獻報道，腦動脈壁繼發的以炎癥反應為主的病理過程使腦血管痙攣進一步加重，是引起DCVS主要因素之一。這種伴隨病理損傷的血管狹窄不同于生理性的血管收縮[3]。腦動脈超微結構檢查可見明顯的炎癥反應及細胞損傷,最明顯的改變是動脈中膜的變性、壞死及動脈壁的以中性粒細胞為主的炎癥細胞浸潤[4]。核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)是眾多細胞因子和炎癥介質表達的主要轉錄因子之一，有研究顯示在腦血管痙攣時痙攣動脈NF-κB的表達增高。NF-κB的活化可使細胞間粘附分子-1(ICAM-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-1(IL-1)等促炎性因子基因大量表達并在許多免疫炎癥疾病中起重要的作用。在本研究中我們采用家兔枕大池二次注血的腦血管痙攣模型，應用免疫組化和免疫蛋白印跡的方法觀察痙攣動脈中NF-кB和TNF-α活性表達的變化，為治療DCVS提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗對象及分組 中國白兔56只，體重2～2.5 kg，雌雄不限。隨機分為3組：對照組(n=8)：不做枕大池穿刺注血，處死； SAH組(n=24)：建立家兔枕大池二次注血模型，麻醉后，應用4.5 G針頭行枕大池穿刺，緩慢抽取腦脊液約1 ml，取未抗凝耳動脈血(1.0 ml/kg)3 min內緩慢注入枕大池，保持頭低腳高位30 min，48 h后重復上述過程。分別在第一次注血后第4天、第7天和第14天分三批處死，每組8只； 假手術組(n=24)：只做枕大池穿刺不注血，第4天、第7天和第14天處死，每組8只。

1.2 HE染色及管徑測量 麻醉后開胸主動脈灌注沖洗并以固定液灌注固定后開顱取含有基底動脈全長的腦干及腦組織，經4%多聚甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋，連續橫行切片，厚度5 μm，常規HE染色。運用ZEISS計算機輔助的影像分析系統測定基底動脈中段的動脈壁厚度和內徑。通過計算動脈口徑比判斷基底動脈痙攣程度：91%～110%為正常；81%～90%為輕度痙攣；70%～80%為中度痙攣；<70%為重度痙攣。

1.3 免疫組化檢測NF-κB和TNF-α的表達 按試劑盒說明操作染色，顯微鏡下觀察NF-κB和TNF-α的表達，用攝像機將切片組織圖像輸入計算機，每張切片隨即選取5個不重疊視野，采用華東理工大學自動化所細胞免疫組織化學分析系統Version 2.0自動分析儀記錄陽性細胞百分率。

1.4 Western blot測定NF-κB和TNF-α活性 麻醉后斷頭處死，迅速開顱取腦冰浴下剝離基底動脈，顯微注射器輕柔沖洗血管腔內血塊，迅速放入液氮中2 min，-70℃冰箱保存。提取細胞總蛋白，通過電泳，轉膜，免疫顯色，與第一抗體反應后硝酸纖維素膜包被，應用TTBS振搖洗膜三次，之后加入以TTBS稀釋的第一抗體溶液(兔抗TNF-α或兔抗NF-κB多克隆抗體1∶500)，封膜后4℃過夜。TTBS洗膜三次，加入以TTBS稀釋的HRP標記的羊抗兔IgG(1∶3 000)封膜后室溫下孵育2 h。再次TTBS洗膜3次，TBS液洗膜2次，加入DAB顯色。將顯色條帶掃描至計算機中，應用AlphalmagerTM 1220 Documentation & Analysis system V5.50對免疫印跡結果進行定量分析，其面積灰度值以積分光密度值(internal optical density，IOD)表示，記錄實驗結果。

2 結果

2.1 基底動脈管徑變化 對照組和假手術組基底動脈內徑及管壁厚度無顯著差異(P>0.05)。SAH組第4天、第7天與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，其基底動脈均出現不同程度管徑變窄，管壁增厚，產生嚴重的腦血管痙攣，以第7天最為明顯。第14天腦血管痙攣程度基本緩解。見表1。

表1不同時間段基底動脈厚度和直徑結果

組別厚度直徑對照組16.86±3.12681.02±35.41假手術組 第4天16.01±3.78658.41±57.22 第7天15.89±3.12661.58±55.32 第14天16.31±2.98653.02±54.46SAH組 第4天25.18±4.43*401.28±23.51* 第7天32.12±4.86#365.56±24.23# 第14天17.89±4.02645.12±52.23

2.2 免疫組化結果 對照組、假手術組免疫組化結果顯示NF-κB少量表達，一直存在于細胞漿內無明顯移位，二者之間比較無明顯差異(P>0.05)；而SAH組NF-κB明顯從胞漿移位于胞核。在SAH組注血后第4天陽性細胞比例和第7天陽性細胞比例較正常對照明顯增高(P<0.01)，NF-κB的免疫反應可以在整個動脈壁內觀察到，著色均勻；NF-κB在胞漿內和胞核內表達，血管內皮細胞與平滑肌細胞均有NF-κB的表達。在注血后第14天 NF-κB陽性細胞比例明顯下降。對照組、假手術組免疫組化結果顯示TNF-α未見表達。SAH組注血后第4天陽性細胞比例和第7天陽性細胞比例明顯升高(P<0.05)，TNF-α的表達可以在動脈壁內皮和外膜觀察到。注血后第14天陽性細胞數表達明顯減少。見表2。

表2不同時間段NF-кB and TNF-α免疫組化結果
(陽性細胞百分比%)

組別NF-кBTNF-α對照組12.23±3.1811.24±2.56假手術組 第4天14.61±4.0813.55±5.41 第7天15.03±3.9514.11±2.38 第14天18.36±5.6219.04±4.25SAH組 第4天58.66±7.34#44.27±5.19# 第7天82.57±8.36#76.53±8.45# 第14天25.62±9.16*19.56±8.44*

2.3 免疫印跡法測定NF-κB及TNF-α含量結果 對照組、假手術組Western-blot僅見有微量NF-κB的表達，二者之間比較差異無統計學意義(P>0.05)；SAH組NF-κB的表達量自第4天開始明顯上升，第7天時達到高峰，差異均有統計學意義(P<0.05)；至第14天，基本恢復至對照組水平。對照組、假手術組Western-blot少量TNF-α的表達，二者之間比較差異無統計學意義(P>0.05)；SAH組自第4天開始，TNF-α含量明顯上升，第7天時達到高峰，差異均有統計學意義(P>0.05)；至第14天，基本恢復至對照組水平。見表3。

表3免疫印跡法測定不同時間段NF-кB和TNF-α表達

組別NF-кBTNF-α對照組1171±376986±277假手術組 第4天1354±5831236±573 第7天1402±2091543±217 第14天1511±1241381±334SAH組 第4天3579±214#4326±316# 第7天8924±362#11214±649# 第14天2119±685*1536±341*

3 討論

蛛網膜下腔出血模型有多種，在本次實驗中，我們采用兔枕大池二次注血制造遲發性腦血管痙攣模型，經術后檢查，模型可靠性較高。遲發性腦血管痙攣是多種因素共同造成的，炎癥反應在DCVS中起重要作用[5]。有學者認為，細胞因子在腦血管疾病中迅速表達提示即早基因，比如c-fos、NF-κB可能激發了細胞因子的調節轉錄過程[6]。

NF-κB是一個廣泛存在于真核細胞內并在機體炎癥反應、免疫應答、細胞生長、分化、凋亡中起重要調節作用的轉錄因子。在腦血管疾病中，參與一系列病理生理反應。在未受到刺激的細胞中NF-κB與其抑制蛋白I-κB結合，以無活性的形式存在于細胞質中，各種胞外刺激均可激活NF-κB，使抑制蛋白I-κB磷酸化、泛素化，與NF-κB解離，并暴露出NF-κB的P50亞基核定位信號，活化的NF-κB進入細胞核，與靶基因上的啟動子或增強子的κB結合位點結合，啟動轉錄。多種炎癥介質基因的啟動子和增強子中存在一個或多個κB序列，活化的NF-κB可單獨或與其它轉錄因子協同參與上述介質基因的誘導表達[7]。NF-κB的靶基因產物有細胞因子、化學趨化因子、粘附因子、急性期蛋白、生長因子、免疫受體、酶、轉錄因子、抑制凋亡因子等，這些被誘導產生的基因產物，可進一步參與炎癥和免疫反應，在機體生理和病理條件下，發揮重要的功能。其中NF-κB激活與TNF-α、IL-1β存在正反饋調節。故本次實驗選擇了NF-κB和 TNF-α作為觀察指標研究炎癥反應在DCVS中的作用機制。

TNF-α參與機體免疫應答和炎癥反應。在炎癥反應和免疫反應中起重要作用。巨噬細胞可以產生TNF-α，使其水平升高，促進炎癥反應。就炎癥而言，TNF-α不僅可以誘導內皮細胞和白細胞產生粘附分子，上調細胞間粘附分子，促進白細胞對毛細血管內皮的粘附。粘附的中性粒細胞被激活引起白細胞脫顆粒釋放自由基、蛋白酶和毒性氧化代謝產物，促發損傷級聯反應，吞噬功能增強，白細胞活化，從而損傷炎癥區的其它細胞，導致水腫、炎癥反應和缺血缺氧的惡性循環。TNF還可誘導內皮細胞和纖維母細胞產生IL-1、IL-6及TNF本身，加重組織損傷[8-10]。

DCVS損傷機制之一即過度的炎癥反應。TNF-α是主要的致炎因子，本研究證實在DCVS中TNF-α表達增加，于第7天最為明顯。TNF-α的釋放可激活多形核白細胞(PMN)，增加白細胞-內皮細胞粘附分子的表達，促進白細胞粘附于血管壁，逐漸滲透至腦組織?；罨腜MN可釋放多種炎癥介質、氧自由基。再者，TNF-α可激活腦內的巨噬細胞、內皮細胞及小膠質細胞產生炎性代謝產物，保持炎性反應，進一步促進活化白細胞進入蛛網膜下腔及痙攣動脈周邊部位，產生再次或長期損傷。另一方面，TNF-α還可促進IL-1、IL-6及粒細胞-單核細胞集落因子的釋放，協同炎性作用。

在SAH后遲發性腦血管痙攣中NF-κB及 TNF-α表達增加，于第7天達到高峰，之后逐漸下降。與DCVS炎性反應時相相符。在DCVS中TNF-α等炎性因子活性增加參與炎癥和損傷級聯反應，加劇組織損傷。

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6 Uno H,Matsuyama T,Akita H,et al.Tumor necrosis factor-αin the mouse hippocampus following transient forebain ischemia.J Cereb Blood Flow Metab,1997,17:491-499.

7 Collins T,Read MA,Neish MZ,et al.Transcriptional regulation of endothelical cell adhesion molecules:NF-kappa B and cytokininducible enhancers.Faseb (FASEB) J,1995,9:899-909.

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ExpressionofTNF-αandNF-кBindelayedcerebralvasospasmafterSAH

LIUYing*,LIUYesong*,LIConghui,etal.DepartmentofNeurology,KailuanGeneralHospitalofTangshanCity,Hebei,Tangshan063000,China

ObjectiveTo observe the expression of TNF-a and NF-кB in delayed cerebral vasospasm (DCVS) after subarachnoid hemorrhage (SAH).MethodsFifty-six Chinese rabbits were randomly divided into three groups:① control group (n=8),the rabbits were not injected;②SAH group (n=24),autologous arterial blood was injected into the cisterna magna at day 0 and day 2,and eight animals were killed respectively at day 4,day 7,and day 14.③Sham-operation group (n=24),the rabbits were punctured,but not injected,and eight animals were killed respectively at day 4,day 7,and day 14.Vasospasm degree was evaluated by calculating diameter and thickness of vertebrobasilar arteries.The expression levels of TNF-α and NF-кB in delayed cerebral vasospasm were detected by immunohistochemistry and Western Blot.ResultsThe animal models with delayed cerebral vasospasm after SAH could be established by blood perfusion into cisterna magna.The expression levels of NF-κB and TNF-α were increased from day 4 (P<0.01),which reached peak at day 7 (P<0.01),and decreased to the levels of control group at day 14.ConclusionThe expression levels of TNF-α and NF-кB are increased in delayed cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage,and inflammatory reaction plays an important role during the process.

delayed cerebral vasospasm;inflammation;TNF-α;NF-κB

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.13.004

063000 河北省唐山市開灤總醫院神經內科(劉穎、劉業松)；河北省石家莊市第一醫院(李聰慧)；石家莊市衛生學校(葉建婭)

R 743.35

A

1002-7386(2014)13-1934-03

2014-01-13)