口腔扁平苔蘚病損區細胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表達研究

滿一 鐘良軍

·論著·

口腔扁平苔蘚病損區細胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表達研究

滿一 鐘良軍

目的通過對口腔扁平苔蘚病變發展過程中細胞凋亡狀況和凋亡相關蛋白表達的研究，探討扁平苔蘚的發病機制。方法采用免疫組化SP法，分析正常口腔黏膜上皮25例，扁平苔蘚組織25例中凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax表達水平及分布差異。結果與正常黏膜比較，Bcl-2在口扁平苔蘚固有層與上皮層均顯過度表達(P<0.05)，隨淋巴細胞聚集密度的增加，其在固有層表達強度也明顯增強，并高于上皮層(P<0.05)。正常黏膜Bax弱表達局限于角化層，口腔扁平苔蘚中Bax表達較正常組明顯增強，隨糜爛程度的加重，Bax表達明顯增強(P<0.01)，分布更廣泛。結論Bcl-2在扁平苔蘚固有層中過度表達抑制了淋巴細胞的凋亡的，強化細胞免疫，Bax過度表達是對異常增殖的上皮細胞和免疫細胞的拮抗反應，試圖通過誘導凋亡，恢復細胞數目的穩定和免疫的平衡，但是過度凋亡致糜爛萎縮皮損。

口腔扁平苔蘚；Bcl-2；Bax

口腔扁平苔蘚(oral lichen planus,OLP)是以紅色扁平丘疹為皮損特點的黏膜性疾病。其組織病理改變包括表皮棘層不規則增生、基底細胞液化、真皮淺層過度的淋巴細胞的浸潤，以及上皮層及真皮淺層變性的角質形成細胞(膠樣小體)，說明免疫細胞與上皮細胞的凋亡平衡出現障礙。因此，通過對OLP細胞凋亡狀況及凋亡相關蛋白的表達研究，探討扁平苔蘚的發病機制，有助于臨床早起診斷和防治。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇中國石油天然氣集團公司中心醫院2006年11月至2009年3月收集的石蠟切片共50例。口腔扁平苔蘚25例，包括非糜爛型15例和糜爛型10例，男9例，女16例；年齡31～77歲，平均年齡(39±9)歲；選取同期正常口腔黏膜25例，男11例，女14例；年齡38～77歲，平均年齡(49±16)歲。 所有檢材診斷和組織學分型均依據WHO標準[1]，由同一名經驗豐富的病理醫生完成。

1.2 試劑 所有試劑均購至福州邁新生物技術有限公司。Bcl-2、Bax為即用型鼠抗人單克隆抗體，SP復合物MaxVisionTM為快捷即用型。DAB顯色試劑盒為鏈霉親和素-辣根過氧化物酶(HPR)免疫組化染色EnVision系統，適用于鏈霉素-過氧化物酶免疫組織化學染色方法(streptavidin-peroxidase,SP)。

1.3 實驗方法 采用免疫組化SP法染色檢測細胞凋亡與增殖狀況。所有組織切片經10%甲醛固定、常規脫蠟、透明、浸蠟、石蠟包埋。5 μm連續切片，固定于經多聚賴氨酸處理的載玻片上，常規組織切片脫蠟入水；微波加熱10 min暴露抗原；3%H2O2溶液阻斷內源性過氧化物酶活性10 min，PBS水沖洗，滴加Bcl-2(按比例稀釋1∶80)、Bax一抗(稀釋度1∶80)，37℃孵育60 min，加入SP復合物HRP-MarVisionTM，30℃孵育60 min，DAB緩沖液、DAB底物、DAB色原順序加入、混勻成DAB顯色液滴定組織切片，室溫下顯色10 min，顯色后蘇木素復染，常規脫水，二甲苯透明，封片。以PBS緩沖液(0.01 mol/L，pH值7.4)作Bcl-2、Bax的陰性對照，以邁新公司提供的淋巴瘤Bcl-2陽性片為陽性對照，胃癌陽性染色切片為Bax的陽性對照。

1.4 結果判定 采用HM2A8-2000彩色醫學圖文分析系統，每例每張切片各隨機選取5個不重復、不重疊10×40倍高清視野，細胞質和細胞核染成棕色或棕紅色顆粒或彌漫成片狀為Bcl-2和Bax的陽性表達。計數視野中1 000個細胞的陽性細胞數。參照Hueber[2]標準，將Bcl-2和Bax定級為：(1)Bcl-2，未見陽性細胞著色為陰性(-)；陽性細胞數<10%為(+)；11%～25%為(++)；26%～50%為(+++)；>50%為(++++)。(2)Bax，陽性反應為棕色到棕紅色顆粒或片狀彌散定位于胞漿，高倍鏡下計數：標本中無陽性細胞為0分，<25%為1分；26%～50%為2分；50%以上為3分，最后求其平均數。染色強度以棕色為1分，深棕色為2分，棕紅色為3分。兩者相乘，0分為陰性(-)，1～3分為弱陽性(+)，4～6分為中等陽性(++)，7～9分為(+++)。

1.5 統計學分析 應用SPSS 11.5統計軟件，因每組樣本數<40，組間凋亡指數采用單因素方差分析，組間Bcl-2、Bax陽性表達率差異采用Fisher精確概率法單因素相關分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 扁平苔蘚與正常黏膜Bcl-2表達比較 扁平苔蘚各組織中Bcl-2蛋白表達率均顯著高于對照組(P<0.05 )；Bcl-2在扁平苔蘚固有層中的陽性檢出率達80.02%，明顯高于其在扁平苔蘚上皮層48.0%的表達率(P<0.05)。見表1。

表1 Bcl-2蛋白在口腔正常黏膜、扁平苔蘚病損各組織中的表達 n=25，%

注：與對照組比較，*P<0.05；與上皮層比較，#P<0.05

2.2 扁平苔蘚與正常黏膜Bax表達的比較 扁平苔蘚各病理分期中Bax蛋白表達均顯著高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 Bax在扁平苔蘚組織中表達

注：與正常口腔黏膜比較，*P<0.05

3 討論

本研究系統地觀察了健康口腔粘膜與OLP各階段病損區細胞凋亡狀況，顯示包括正常粘膜在內的所有上皮細胞均有Bcl-2、Bax表達。正常口腔黏膜中，上皮細胞Bcl-2陽性表達率為16%，主要分布在上皮基底細胞層及棘層，固有層罕見Bcl-2陽性表達淋巴細胞，表達程度較均一。Bax為弱陽性表達，點狀散在分布于棘層等角化層，并且上皮各層次趨于完整，界面清晰，細胞結構基本未破壞，見圖1、2。這符合黏膜上皮細胞分裂起源于基底層并逐漸向角化層移行成熟、衰老、凋亡的生理特征。Bcl-2適當表達可保證角質形成細胞分裂發生，完成連續的細胞周期。而當細胞周期完成即將通過凋亡發生克隆消失時，Bcl-2的表達則下調，Bax代償性升高，促進細胞凋亡，以保持細胞數目的動態平衡及維持粘膜上皮的分層結構。

Bcl-2蛋白過表達，則細胞壽命延長，數量累積。實驗結果統計顯示：扁平苔蘚上皮細胞中Bcl-2陽性細胞表達率48%，中等強度以下的陽性染色居多。扁平苔蘚組織內自身對照，隨固有層淋巴細胞聚集密度的增強，糜爛型Bcl-2陽性染色率跳躍式增加，在真皮淺層密集的淋巴細胞帶，陽性檢出率達80%，見圖3、4，明顯高于上皮層(P<0.05)，無論上皮層，還是固有層，扁平苔蘚組織中的Bcl-2的表達率均高于正常對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。從皮損與Bcl-2陽性細胞分布之間關系上觀察，多數病例(18例，72%)上皮層變性與Bcl-2陽性表達之間似有較明確的上下對應關系，既真皮淺層淋巴細胞Bcl-2特異免疫反應活躍區域，在其上方既可以出現上皮棘層楔形增厚，又能觀察到基底細胞液化變性，基底細胞液化變性和細胞浸潤呈真皮淺層不連續的帶狀分布；而當固有層Bcl-2陽性淋巴細胞連續性發生斷裂時，只有點狀、散在Bcl-2陽性細胞浸潤時，基底層則趨于完整，棘層也無明顯增厚。目前大多數研究認為口腔扁平苔蘚發病與發展可能與T細胞免疫介導失衡相關[10]，其組織病理學上表現為上皮乳突層下淋巴細胞數量遷移、聚集。因此推測：(1)上皮基底層的液化變性并不是內在因素所致，而是Bcl-2活化后的淋巴細胞攻擊和誘導。Bcl-2的過度表達抑制了淋巴細胞凋亡，加強特異性細胞毒性T細胞的活性，從而殺傷角質形成細胞，造成基底細胞液化。這種損傷主要是Tc細胞、NK細胞通過釋放穿孔素致角質細胞液化變性[3]；(2)Bcl-2與生發中心的T細胞有高度的親和力，Bcl-2在T淋巴細胞發育成熟期活性增強，過表達使自身反應性T淋巴細胞逃避了胸腺的陰性選擇而持續存在[4]；(3)OLP中淋巴細胞的聚集可能受到Bcl-2激活趨化。被淋巴細胞破壞后的上皮細胞又可以產生RANTES(RANTES)、IL-6等炎性因子，而Bcl-2誘導活化后的T淋巴細胞受體對RANTES、IL-6敏感性增強，游走能力增強，吸引更多的淋巴細胞穿越血管內皮到達皮損區[5]。

除真皮層過度的淋巴細胞浸潤外，在組織病理上OLP屬于苔蘚樣界面皮炎，上皮增殖也是其特點。與正常口腔上皮比較，本實驗也顯示部分病例(18例，72%)中Bcl-2反應活躍區域，顆粒層楔形增厚，棘層不規則增厚，角化不全。據此推測，Bcl-2的過表達干擾了細胞正常分化，延長上皮細胞分裂周期，細胞個體壽命延長，“凋亡細胞”的繼續生存影響細胞數量增加。對于細胞分化和凋亡的關系，有學者認為是兩個不同的過程，也有學者認為是同一過程[6]。由于凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2生物學作用、表達分布與正常上皮細胞分化周期特征一定程度的扣合，因此推測口腔黏膜這一特定的鱗狀上皮其分化和凋亡可能是同一過程，或至少存在著某種相同的途徑。

扁平苔蘚病理組織學的特點是上皮中既有增殖性改變，部分病例又有萎縮性表現。本實驗顯示25例口腔扁平苔蘚中有20例Bax蛋白顯過度表達，多著色于細胞質與胞外基質，陽性表達率與正常黏膜比較差異有統計學意義(P<0.05)，并且中等強度以上的陽性率明顯增加。隨病損程度的加重，特別是糜爛型扁平苔蘚中Bax陽性表達率達到最高值(86%)。在組織中分布也更廣泛，上皮棘層、顆粒層、固有層淋巴細胞浸潤處均有彌散性分布，與Bcl-2表達分布有部分 “交叉覆蓋”，見圖5、6。相關的研究資料也證實扁平苔蘚上皮中確實存在細胞凋亡現象，上皮層及真皮淺層變性的膠樣小體，既是角朊細胞發生凋亡后形成的凋亡小體[7]。本實驗觀察到在其中3例萎縮性改變的病例中，表現出上皮細胞層次減少或界面模糊，部分上皮突消失，而Bax在此區域內的角質形成細胞上免疫反應強烈，其分布與萎縮性上皮改變的結果基本一致，見圖7。因此我們推測Bax的表達代償性升高，表明機體為了抑制過度生長的細胞群體而采取了一系列的自穩態機制，新生細胞開始啟動了細胞自穩定機制，它試圖通過Bax/Bax蛋白表達的強化而拮抗細胞異常增殖，促進異常增殖旺盛細胞包括免疫細胞的凋亡，從而維持細胞數目的穩定和免疫的平衡，而由于Bax的過表達，角質形成細胞迅速進入凋亡，表皮更替時間縮短，導致上皮糜爛萎縮。另外研究顯示Bax蛋白陽性表達率在糜爛型扁平苔蘚階段達到最高值，而同一病理分期中，Bcl-2表達則有所下降，低于非糜爛型，Bax和Bcl-2在扁平苔蘚組織中呈反向表達，說明扁平苔蘚發展過程中存在促凋亡與凋亡抑制的相互傾軋傾向。

圖1 Bcl-2染色在正常黏膜中的表達(SP×400)圖2 Bax染色在正常口腔黏膜中的表達(SP×400)

圖3 Bcl-2染色在糜爛型OLP組織中的表達(SP×400)圖4 Bcl-2染色在非糜爛型OLP組織中的表達(SP×400)

圖5 Bax染色在糜爛型OLP組織中的表達(SP×400) 圖6 Bax染色在非糜爛型OLP組織中的表達(SP×400)

圖7 Bax染色在非糜爛型OLP中的表達(SP×400)

關于細胞數目自穩定啟動機制，Adams等[8,9]認為除Bax、Bcl-2和Bak，在Bcl-2凋亡蛋白家族中還有一個單BH3結構域蛋白，單BH3結構域蛋白Bim、Bmf能夠與線粒體膜外的抗凋亡Bcl-2家族蛋白相互作用，其活性通過轉錄誘導、翻譯后磷酸化、細胞骨架扣押等機制調節，從而結合并拮抗抗凋亡的Bcl-2家族蛋白來誘導細胞凋亡。當接到凋亡信號后，Bax與Bak在線粒體外膜聚集，形成允許細胞色素C通過的通道。在正常細胞中，Bim、Bmf被分別扣押在線粒體微管和肌球蛋白而保持無活性狀態，磷酸化可以調節Bax的活性。

1 WHO Collaberating Center for Oral precancerous Lesions Definition of leukoplakia and related lesions: an aid to studies on oral precancer，1978，1016：90383.

2 Hueber A,Welsand G,Jordan JE,et al.Characterization of CD95 Ligand(CD95L) induced apopatosis in human being fibroblasts.Exp Eye Res,2002,75:1-8.

3 雷蕾,詹麗華,譚為霞，等.口腔扁平苔蘚局部浸潤淋巴細胞顆粒酶B和穿孔素蛋白表達與上皮凋亡的關系.第三軍醫大學學報，2011，102:105.

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6 Gannecchini M,Innocenzo B,Pesi R，et al.2-Deoxyadenosine cause apoptosis cell death in a human colon carcinoma cell line.Biochem Mol Toxicol,2003,17:329-337.

7 Reed JC,Matsuyama S.Bcl-2 family proteins and mitochondria.Biochim Biophys.Acta,1998,1366:127-137.

8 Adams JM.Ways of dying multiple pathways to apoptosis.Genes Dev,2003,17:2481-2495.

9 Villunger A,Michalak EM,Coultas L,et al.p53- and drug-induced apoptotic responses mediated by BH3-only proteins puma and noxa.Science,2003,302:1036-1038.

Studyontheexpressionofcellularapoptosis-proteinsBcl-2andBaxexpressioninorallichenplanus

MANYi*,ZHONGLiangjun.*DepartmentofStomatology,CentralHospitalofChinesePetroleumandNaturalGasCorporation,Hebei,Langfang065000,China

ObjectiveTo explore the pathogenesis of oral lichen planus(OLP) through examining the expression of apoptosis-associated protein Bcl-2 and Bax in OLP.MethodsThe expression levels and distribution of Bcl-2 and Bax were detected by immunohistochemistry(SP) in 25 cases of normal mucosa and 25 cases OLP tissues.ResultsAs compared with that in normal mucosa,overexpression of Bcl-2 was found in lamina propria and epithelial lining of OLP(P<0.05),the expression levels of Bcl-2 in lamina propria of OLP were increased with the increase of lymphocyte aggregation dencity,which were significantly higher than those in epithelial lining of OLP(P<0.05).The weak expression of Bax in normal mucosa was limited in cuticular layer,however,the expression levels of Bax were increased,as compared with those in normal mucosa,moreover,which were further increased with the aggravation of erosion degree(P<0.01),and its distribution was more wide.ConclusionThe overexpression of Bcl-2 in lamina propria of OLP inhibits apoptosis of lymphocytes and strengthens cellular immunity.The overexpression of Bax is antagonism reaction to epithelial cells and immunocyte of abnormity proliferation,which try to recover stabilization of cell number and immune balance by inducing cell apoptosis,however,excess apoptosis can result in erosion,atrophy,skin injury in OLP.

oral lichen planus; Bcl-2; Bax

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.11.007

065000 河北省廊坊市，中國石油天然氣集團公司中心醫院口腔科(滿一)；杭州師范大學醫學院口腔醫學系(鐘良軍)

R 25

A

1002-7386(2014)11-1623-04

2013-11-26)