苗藥組方霧化劑對染矽塵肺纖維化大鼠模型血清SOD、NO水平及肺組織細胞凋亡基因FasL表達的影響*

★ 黃高 何光志* 宋貴喜 王昆 劉霞 王文佳 楊長福

(1.貴陽中醫學院 貴陽 550002；2.貴州省總隊離職干部休養所 貴陽 550002)

矽肺(silicosis)是塵肺中最為嚴重的一種類型，通常由于長期吸入含有游離二氧化硅(SiO2)的粉塵所引起。如果空氣中游離二氧化硅的含量越高，顆粒越小(1-4μm)，接觸時間越長，越易發病，病情進展愈快，病變會越發嚴重。矽肺的主要病理改變是肺組織彌漫性纖維化，臨床表現活動性呼吸困難、限制性通氣障礙、彌散功能降低和低氧血癥等。本病屬中醫學的“咳嗽”、“肺痿”、“肺脹”等范疇。本病病位在肺,本虛標實，本虛為肺虛津氣失于濡養，標實則多為痰(熱)瘀毒，同時與肝、脾關系密切。

到目前為止，中醫、西醫治療矽肺患者的手段比較局限，而采用苗醫藥防治矽肺患者的報道很少。因此，本研究能夠給臨床防治矽肺提供新的思路與方法，通過對矽肺患者辯證論治，并結合貴州省名中醫朱祝生教授治療矽肺患者已取得的臨床經驗。苗藥霧化劑由鼠曲草、巖壁菜、巖豇豆、枇杷樹根、矮地茶、鐵掃帚、吉祥草、折耳根、白果和黃芪組成，具有清肺止咳，祛濕化痰之功效；中藥組方由半夏、茯苓、陳皮、桔梗、蘇子、葶藶子、海浮石、黃芪、黨參、丹參、當歸、川芎、三七和甘草組成，具有化痰止咳，補虛化瘀之功效。通過對染矽塵大鼠肺纖維化肺動物模型進行實驗動物血清的SOD、NO以及肺組織中FasL基因進行檢測，探索苗藥組方霧化劑對矽肺的影響。

1 材料與主要儀器

1.1 動物 清潔級SD大鼠，體重180-220g，雄性，購自重慶市中藥研究所實驗動物研究所(許可證號：SCXK(渝)2007-0006)。

1.2 與試劑 苗藥組方霧化劑(貴陽中醫學院藥學院制備)；中藥購于貴陽中醫學院一附院；地塞米松磷酸鈉注射液(貴州光正制藥有限責任公司，1mL：5mg×10支，國藥準字HS2020793)；二氧化硅結晶型標準品(美國Sigma公司)純度99%,粒子直徑在0.5-10μm間,其中80%在1-5μm間；DNA Marker DL2000和2×TaqPCR Master Mix(大連寶生物工程有限公司)；總RNA抽提試劑盒和逆轉錄試劑盒(GIBCOBRL公司產品)；超氧化物歧化酶(SOD)WST-1法測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號：A001-3)；一氧化氮(NO)測試盒(南京建成生物工程研究所，貨號：A013-2)。

1.3 主要儀器 紫外分光光度計(美國Pharmacia Biotech)；低速離心機(LD4-2)，北京醫用離心機廠；超生波霧化器(粵華WH-2000)；超低溫冰箱(Thermo Scientific Revco PLUS新型 -86℃)；德國Hettich低溫高速離心機；控溫水浴搖床(美國FORMA)；超微量全波長酶標儀(美國Multisksn Go)；顯微鏡攝像CCD照相系統(日本DP73+standard1.6)。

2 方法

2.1 造模 按照《實驗動物學教程》“矽肺模型造模”方法[1]，選用清潔級SD大鼠58只(造模過程中死亡7只)，隨機分為對照組(生理鹽水組)、染矽塵組(二氧化硅模型組)、治療1組(糖皮質激素霧化組)、治療2組(苗藥組方霧化劑霧化組)及治療3組(苗藥組方霧化劑合中藥組)。各組大鼠10%水合氯醛麻醉后，氣管注入1mL各實驗用液體，立即將大鼠頭部抬起直至大鼠完全直立，令實驗用液體在兩肺均勻分布。對照組注入滅菌生理鹽水，模型組和治療組給予50mg/mL二氧化硅粉塵懸液。待造模成功后，在15L玻璃容器內(霧化時預留通氣口)，治療1組給予糖皮質激素5mg(生理鹽水配)每天霧化15min(霧化量0.5mL/min)，治療2組給予苗藥組方霧化劑每天霧化40分鐘(霧化量0.5mL/min)，治療3組給予苗藥組方霧化劑霧化每天40min(霧化量0.5mL/min)加中藥灌胃，每周7次。對照組、模型組、治療1、2組給予等體積的生理鹽水灌胃，各組動物于造模成功后40d處死。

2.2 動物處理及標本采集 造模30d后，隨機取模型組大鼠肺組織HE染色。治療組治療結束后，各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主動脈采血離心3000r/min,15min取血清，同時取大鼠肺組織-80℃儲藏備用。

2.3 SOD抑制率測試 將每組每份待測血清分別取20μL放入測定孔中，另取1例對照組血清20μL。放入測定空白孔中，在對照孔和對照空白孔中分別加入雙蒸水20μL，然后在對照孔和測定孔中分別加入酶工作液20μL，在對照空白孔和測定空白孔中分別加入酶稀釋液20μL，最后在各孔中分別加入底物應用液200μL，通過超微量全波長酶標儀檢測每份血清的SOD抑制率。

2.4 NO含量測定 按照南京建成生物工程研究所提供的一氧化氮(NO)測試盒(貨號：A013-2)說明書步驟，通過超微量全波長酶標儀檢測每份血清NO含量。

2.5 RNA提取與RT-PCR檢測 從-70℃超低溫冰箱取出待檢組織，采用RNA抽提試劑盒進行抽提肺組織的總RAN，在分光光度計上測量吸光度。以總RAN為模板，以Oligo(dT)18為引物進行反轉錄。根據根據FASL在GenBank登錄序列(MMU06948)，采用引物設計軟件設計引物：FASL-Forward：5-CTACCACCGCCATCACAACC-3；Reverse：5-GTTTAGGGGCTGGTTGTTGC-3,，擴增序列456bp;內參基因-Forward：5'-TGA ACG GGA AGC TCA CTG G-3'，Reverse：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGGA-3'，其擴增產物長度為307 bp。采用25μL反應體系，PCR反應體系為：2×TaqPCR Master Mix:12.5μL；cDNA產物：1.5μL；無菌水：9.5μL，上下游引物各0.75μL。采用PCR技術檢測各組肺組織細胞凋亡基因FASL表達影響。擴增產物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，用Bio-RadQuantity One軟件對電泳條帶進行掃描和光密度分析。

2.6 統計學處理 所有結果均以均數標準差表示用SPSS21.0軟件進行方差分析P﹤0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 模型癥狀觀察 照模后，發現各造模大鼠呼吸急促，喘息明顯，飲食下降，身體倦怠，精神萎靡，體重減輕。

3.2 模型組大鼠肺組織大體觀察HE染色 正常對照組大鼠肺組織見圖1。造模30天后，隨機取大鼠肺組織肉眼觀察發現模型大鼠雙肺有針尖大小散在灰白色結節，觸之有砂粒感。HE染色，光鏡下可見模型組肺泡壁破壞，結構紊亂，肺泡腔擴大，間質內有大量炎細胞浸潤、巨噬細胞增多,出現明顯矽結節，結節由成纖維細胞、纖維細胞和膠原纖維組成，呈同心圓結構。見下圖2。

圖1 正常組大鼠肺組織(HE×200倍)

圖2 染矽塵大鼠矽結節模型(HE×200倍)

3.3 血清SOD抑制率變化和NO含量變化 對照組血清中SOD抑制率明顯高于染矽塵組(差異有統計學意義，P﹤0.05)。通過不同途徑治療后，治療1、2和3組血清中SOD活力明顯高于染矽塵組(差異有統計學意義，P﹤0.05)，各治療組治療效果相當。說明通過不同途徑給藥后，藥物對染矽塵大鼠血清SOD抑制率有增強作用，苗藥組方霧化劑對增加染矽塵大鼠血清SOD活力有一定效果。

染矽塵組血清中NO含量明顯高于對照組(差異有統計學意義，P﹤0.05)。通過不同途徑治療后，染矽塵組血清中MDA含量明顯高于治療1、2和3組(差異有統計學意義，P﹤0.05)，治療2、3組優于治療1組。說明通過不同途徑給藥后，藥物對降低染矽塵大鼠血清NO含量的作用，苗藥組方霧化劑對減少染矽塵大鼠血清NO含量有一定效果。

表1 各組大鼠血清SOD抑制率和NO含量變化±s，n=10)

3.4 FasL基因表達檢測 經過RT-PCR擴增FasL基因，與對照組肺組織比較，發現染矽塵組、治療1組、治療2組和治療3組肺組織FasL-mRNA含量明顯高于對照組(P﹤0.05)，染矽塵組肺組織FasL-mRNA含量明顯高于其他各組(P﹤0.05)，治療1組、治療3組和治療2組各組間肺組織FasL-mRNA含量存在差異有統計學意義(P﹤0.05)。結果提示通過不同途徑給藥后，中西藥物對染矽塵大鼠肺組織FasL基因表達有抑制作用，但苗藥組方霧化劑具有顯著降低染矽塵大鼠肺組織FasL基因表達作用，結果見表2。

表2 各組大鼠肺組織FasLmRNA表達結果比較±s，n=10)

4 討論

在矽肺的形成過程中，動物體內會產生大量的自由基，從而導致機體內氧化/抗氧化失衡，這種失衡是粉塵所致肺組織損傷的原因之一。SOD是體內清除氧自由基的重要酶，SOD抑制率水平越低反映機體自由基的清除能力越低。NO在生物體內是一種反應性極強的自由基，兼有第二信使和神經遞質的作用，NO含量越高說明機體內自由基含量增多。本次研究發現，染矽塵組大鼠血清中SOD抑制率水平明顯降低，NO含量明顯增加，通過苗藥組方霧化劑霧化治療后，大鼠血清中SOD抑制率明顯增加，NO含量明顯下降，苗藥組方霧化劑配合中藥灌胃作用更明顯。

FasL主要在被激活的T細胞和B細胞上表達[2]。它能誘發大鼠肺組織細胞凋亡，在多種肺疾病的發生和發展中起重要作用，表達量越高說明細胞凋亡越顯著。本次研究中發現，染矽塵組大鼠肺組織FasL基因表達明顯高于其他各組，通過苗藥組方霧化劑霧化治療后，大鼠肺組織FasL基因表達能明顯下降，苗藥組方霧化劑配合中藥灌胃效果更好。

通過本項研究證明，激素對矽肺的治療是有效的，但不能夠大劑量長期使用，在預示實驗過程中發現，按常規量霧化超過30天后霧化大鼠會食欲下降，食量減少，體重減輕，繼續下去會很快死亡，因此本項實驗治療1組每次霧化的激素量都有所減少，苗藥組方霧化劑在霧化過程中沒有發生此類情況，并對矽肺的治療有一定的效果，中藥灌胃能增強苗藥組方霧化劑的治療效果，兩者可以搭配使用。

[1]胡建華，姚明，崔淑芳.實驗動物學教程[M].上海：上海科學技術出版社，2009：1.

[2]袁紅.Fas/FasL與凋亡研究進展[J].國外醫學-生理病理科學與臨床分冊，2000，20(1)：26-29.