水蛭提取物對HL-60細胞增殖與分化的影響

★ 肖移生 侯吉華 廖夫生 朱大誠

(1.江西中醫藥大學基礎醫學院 江西 南昌 330004；2.江西中醫藥大學藥學院 江西 南昌 330004)

水蛭，俗稱螞蝗。其性咸、苦、平，歸肝經，有破血、逐瘀、通經等功效，臨床上用于治癥瘕、痞塊、血瘀閉經、跌打損傷等。其藥理作用為抗凝、溶栓、抗血小板及降血脂等[1]，可單方或組方用于腫瘤的治療[2]。本課題組前期研究發現，水蛭提取物對HL-60細胞生長有抑制作用[3]，為進一步深入研究，本課題組進行了水蛭提取物對HL-60細胞增殖與分化影響的實驗。

1 材料與方法

1.1 細胞株及培養方法 HL-60細胞購自中國醫學科學院基礎醫學研究所基礎醫學細胞中心，由江西中醫藥大學基礎醫學院實驗中心保存。將HL-60細胞置于含有10%新生小牛血清的RPMI1640完全培養基中(37℃，5%CO2飽和濕度)，培養至細胞處于對數生長期，備用于后續實驗。

1.2 主要試劑 RPMI1640培養基和新生小牛血清為美國GIBCO公司產品，全反式維甲酸(All trans-retinoic acid, ATRA)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、佛波酯(TPA)均為美國Sigma公司產品，小鼠抗人CD11b、CD14 FITC熒光標記抗體為Immunotech公司產品。

1.3 藥物 水蛭原藥材購于江西中醫藥大學第一附屬醫院中藥房，并經我校中藥資源學科組鄧可眾副教授鑒定且符合國家中藥臨床應用標準。水蛭用超微粉碎機粉碎，提取物以液氮快速凍融法制備[4]：取水蛭超微粉1.5g置15mL離心管內，加10mL無菌雙蒸水制成混懸液，再將離心管置液氮內5min，取出，立即放入37℃水浴中迅速融解，重復3次，再3000 r/min離心10min。取上清液過濾，濾液冷凍干燥18h即得水蛭凍干粉，-20℃保存備用，臨用前用培養基配成實驗所需濃度工作液，再經0.22μm無菌濾器正壓過濾除菌。

1.4 MTT試驗 取對數生長期的HL-60細胞，以5.0×104/mL細胞濃度置于96孔培養板內培養，同時用水蛭提取物(根據前期實驗結果，設0.7g、1.4g、2.8g/L)再處理HL-60細胞48h，同時設對照孔，到時間點后各孔加入MTT液(20μL/孔)，每組10個復孔，4h后終止培養，以1000r/min離心5min，去除上清，加入DMSO(150 μL/孔)使結晶物溶解，用自動酶標儀在波長490nm處測吸光度A值，實驗重復5次，得出量效關系。按下列公式計算細胞抑制率：細胞生長抑制率(%)=(對照孔A值-試驗孔A值)/對照孔A值×100%。

1.5 NBT還原實驗檢測[5]HL-60細胞經過水蛭提取物處理48h后，收集各實驗組的細胞(每組10個復孔)，用臺盼藍試劑檢測細胞活性并計數，取含有1×106個活細胞的100μL細胞懸液，加入100μL含2 mg/L TPA的1% NBT試劑，放入37℃培養箱中繼續培養1h，離心后丟棄上清液，每個實驗組加入200μL的DMSO，混勻后加于96孔板，用酶標儀在波長570nm處測量吸光度A值，吸光度A值越大表示細胞分化程度越高。實驗重復5次。

1.6 FCM檢測HL-60細胞膜表面CD11b、CD14抗原 HL-60細胞經過水蛭提取物處理48h后，收集各實驗組的細胞，用臺盼藍試劑檢測細胞活性并計數，取含有5×105個細胞，PBS漂洗1次，用100μL PBS重懸細胞，分別加入20μL相應抗體，避光孵育30min，流式細胞儀(FCM)檢測，每個樣本至少檢測1×104個細胞。實驗重復5次。

2 結果

2.1 水蛭提取物對HL-60細胞增殖的抑制作用 各濃度的水蛭提取物處理HL-60細胞48h后，MTT檢測結果顯示,水蛭提取物以劑量依賴性方式抑制HL-60細胞增殖，抑制率隨水蛭提取物濃度增高而增加。各試驗組與正常組比較均有統計學差異(P<0.05，P<0.01)，詳見表1。

表1 水蛭提取物對HL-60細胞增殖的抑制作用

表2 水蛭提取物對HL-60細胞分化及CD11b、CD14表達的影響

圖1 水蛭提取物影響HL-60細胞表達CD11b圖

2.2 水蛭提取物對HL-60細胞分化的影響 成熟的髓系細胞(粒細胞、單核細胞)具有吞噬能力，受到TPA刺激后可將黃色的NBT還原，生成藍紫色的甲簪沉淀，因此細胞對NBT的還原能力可在一定程度上反映其分化水平[5]。檢測結果顯示，水蛭提取物以劑量依賴性方式誘導HL-60細胞分化，誘導率隨水蛭提取物濃度增高而增加。各試驗組與正常組比較均有統計學差異(P<0.05，P<0.01)，詳見表2。

2.3 水蛭提取物對HL-60細胞膜表面CD11b、CD14表達的影響 CD11b、CD14分別是粒系及單核系分化的標記物。經各濃度的水蛭提取物處理48h后，HL-60細胞膜表面CD11b表達升高，且隨水蛭提取物濃度增高而增加，各試驗組與正常對照組比較均有統計學差異(P<0.01)，見表2、圖1。這表明水蛭提取物可以誘導HL-60細胞向成熟粒系分化，這種促分化的效果隨著水蛭提取物濃度的增加而明顯。

CD14在正常對照組的HL-60細胞與各濃度水蛭提取物處理的HL-60細胞中表達率比較，無統計學差異，表明水蛭提取物誘導的HL-60細胞不是朝著單核系方向分化。

3 討論

水蛭始載于《神農本草經》，有破血、逐瘀、通經等功效，廣泛用于心腦血管及血栓性疾病的治療，水蛭也是治療腫瘤疾病常用的一味活血藥。現代研究發現，水蛭抗腫瘤的主要活性成份有凝血酶抑制劑及蛋白酶抑制劑等，含量中主要是水蛭素、溶纖素等[6]。我們前期研究發現，水蛭提取物濃度高于0.1mg/mL時對HL-60細胞有明顯的抑制作用，并呈時間和劑量依賴性。經計算，作用HL-60細胞48h時的水蛭提取物IC50=1.4mg/mL，故本研究中將水蛭提取物設為0.7g、1.4g、2.8g/L(低、中、高劑量)三個劑量作用HL-60細胞48h時間段進行研究[3]。

NBT還原實驗和表面分化抗原的檢測兩個實驗的結合廣泛用于白血病誘導分化實驗的研究。NBT的還原試驗發現，水蛭提取物在0.7～2.8g/L劑量范圍內以劑量依賴性方式誘導HL-60細胞分化，且誘導率隨水蛭提取物濃度增高而增加；進一步運用流式細胞儀檢測水蛭提取物對HL-60細胞膜表面CD11b、CD14的表達發現，經各濃度的水蛭提取物處理48h后，HL-60細胞膜表面CD11b表達升高，且隨水蛭提取物濃度增高而增加，但水蛭提取物處理HL-60細胞前后的CD14表達均為陰性。這說明水蛭提取物誘導HL-60細胞分化是通過誘導HL-60細胞向成熟粒系方向分化，而非向單核系分化。

腫瘤細胞的增殖能力與其分化程度密切相關，分化程度差的細胞往往比分化程度好的細胞增殖活躍，故臨床上常通過誘導腫瘤細胞向成熟細胞方向分化、降低細胞增殖，以達到治療腫瘤的目的[7]。研究表明，白血病的發生發展與細胞增殖和分化之間的平衡失調有關，表現為增殖失控而分化受阻。如果藥物可以誘導白血病細胞向正常體細胞分化，將明顯減輕化療藥物引起的副作用[8]。我們的實驗表明，水蛭提取物有良好的抑制HL-60細胞增殖作用，2.8g/L的水蛭提取物抑制HL-60細胞增殖率達62.25%；進一步研究發現，水蛭提取物也能誘導HL-60細胞向成熟粒系方向分化，2.8g/L的水蛭提取物誘導HL-60細胞的CD11b表達率達34.77%±5.58%。這就說明水蛭提取物抑制HL-60細胞增殖的機理之一是通過誘導HL-60細胞向成熟粒系方向分化而發揮作用的；另外，水蛭提取物抑制HL-60細胞增殖可能還有其它作用機理，有待進一步研究。

[1]周樂，趙文靜，常惟智.水蛭的藥理作用及臨床應用研究進展[J].中醫藥信息，2012，29(1)：132-133.

[2]張娟，張媛.淺談水蛭在腫瘤疾病中的運用[J].湖南中醫雜志，2006，22(4)：69.

[3]肖移生，廖夫生，趙志冬，等.水蛭提取物對人白血病HL-60細胞體外抑制作用研究[J].江西中醫學院學報，2013，25(4)：63-65.

[4]郭永良，田雪飛，肖竺.水蛭提取物對人肝癌HepG2細胞體外抑制作用研究[J].中國中醫藥信息雜志，2009，16(8)：30-31.

[5]Li D, Wang Z, Chen H, et al. Isoliquiritigenin induces monocytic differentiation of HL-60 cells[J]. Free Radic Biol Med, 2009, 46(6) :731-736.

[6]王艷，楊培民，代龍，等.水蛭提取方法及生理活性的研究[J].中國生化藥物雜志，2012，33(1)：27-30.

[7]Ruch JM, Kim EJ. Hedgehog signaling pathway and cancer therapeutics: progress to date[J]. Drugs, 2013,73(7): 613-623.

[8]Ernst T, Hochhaus A. Chronic myeloid leukemia：clinicaI impact of BCR-ABL1 mutations and other lesions ass∞iated with disease progression[J].Seminars In Oncology, 2012,39(1):58-66.