青蒿素對小鼠Lewis肺癌的抑制及TNF-α和IFN-γ的影響*

★ 鄭紹琴 劉亞軍* 宋健平 高巖 鄧長生

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)科技產(chǎn)業(yè)園 廣東 廣州 510445；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 廣東 廣州 510405)

惡性腫瘤是對人類健康和生命威脅最嚴(yán)重的疾病之一，而肺癌是發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，據(jù)全球2002年癌癥統(tǒng)計(jì)資料，無論從發(fā)病率和死亡率來看，肺癌都排在所有惡性腫瘤之首。目前對于腫瘤的治療主要包括手術(shù)、放射治療、化學(xué)治療和生物免疫治療。化療在絕大多數(shù)的惡性腫瘤治療中有著重要的地位，尤其在肺癌的治療中發(fā)揮著重要的作用，但化療的有效率低，毒副作用大，中藥聯(lián)合化療藥物提高化療的有效率已成為目前研究的熱點(diǎn)。青蒿素artemisinin,ART)是中國藥學(xué)工作者1971年從菊科植物黃花蒿葉中提取分離到的一種具有過氧橋的倍半萜內(nèi)酯類化合物，因其毒性低、抗瘧性強(qiáng)，被WHO批準(zhǔn)為世界范圍內(nèi)的治療腦型瘧和惡性瘧的首選藥物。近年來國內(nèi)外許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素類藥物不僅是一種抗瘧藥物，而且具有一定的抗腫瘤細(xì)胞活性和抑制腫瘤的作用。雖然在這方面目前國內(nèi)外尚缺乏大樣本的研究報(bào)道，但眾多的研究表明青蒿素及其衍生物應(yīng)用于臨床腫瘤治療的前景是非常好的。本實(shí)驗(yàn)旨在拓寬青蒿素作為化療輔助用藥的適應(yīng)證，并初步探討青蒿素對Lewis肺癌小鼠的抑瘤作用及機(jī)制。

1 材料

1.1 藥物 青蒿素(廣州漢方現(xiàn)代中藥研究有限公司，批號為100651)，注射用0.5%環(huán)磷酰胺(0.2g/瓶，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，產(chǎn)品批號11050821)。

1.2 動(dòng)物 健康C57BL/6小鼠70只，雌雄各半，4～6周齡，小鼠質(zhì)量16±2g，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證：SCXK(粵)2008-0002。

1.3 瘤株 小鼠Lewis瘤株，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)青蒿中心提供。

1.4 試劑 NF-α和IFN-γ ELISA試劑盒：購于廣州博勝生物技術(shù)有限公司。

1.5 主要儀器 37XAZ型倒置顯微鏡，上海光學(xué)儀器廠；SW-CJ-IF超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；洗板機(jī)BIORAD 1575；酶標(biāo)儀BIORAD MODEL 680。

2 方法

2.1 肺癌動(dòng)物模型的建立 在無菌條件下，取傳代10d的Lewis肺癌瘤源小鼠，頸椎脫臼處死，無菌操作從腋部皮下剝?nèi)∧[瘤組織，研磨后按1∶3比例加生理鹽水稀釋成瘤細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL，取C57BL/6J小鼠，每鼠0.2mL右前肢腋部皮下注射。

2.2 動(dòng)物分組及給藥 健康C57BL/6J小鼠70只，隨機(jī)分出10只作為正常對照組，其余動(dòng)物造模24h后稱重，并隨機(jī)分為模型對照組、陽性對照組(CTX)、聯(lián)合用藥組(CTX+ART)，ART高、中、低劑量組，每組10只。分組后模型對照組和正常對照組，灌胃給予等容積CMC-Na溶液；ART高、中、低劑量組分別按200mg/kg、100mg/kg、25mg/kg灌胃給藥，每日1次，連續(xù)12d；陽性對照組CTX按20mg/kg每鼠腹腔注射0.2mL，每日1次，連續(xù)12d；聯(lián)合用藥組CTX按20mg/kg每鼠腹腔注射0.2mL，ART按100mg/kg灌胃給藥，每日1次，連續(xù)12d。治療期間每天觀察小鼠對治療的反應(yīng)、活動(dòng)情況、精神狀態(tài)、脫毛等情況。

2.3 腫瘤體積變化曲線 分組給藥后，隔天測一次各組小鼠腫瘤組織的長短徑，計(jì)算腫瘤體積：

V(mm3)=0.5×長徑×短徑×短徑

計(jì)算瘤體積，取均值繪制腫瘤體積變化曲線。

2.4 脾質(zhì)量、胸腺質(zhì)量和抑瘤率計(jì)算 末次給藥后24h，頸椎脫臼處死小鼠，剝?nèi)×鰤K，分離胸腺和脾臟并稱重。按下列公式計(jì)算抑瘤率：

2.5 聯(lián)合用藥協(xié)同作用評價(jià) 聯(lián)合用藥效果按金氏公式評價(jià)[1]：

其中Ea+b為兩藥合用的抑制率，Ea和Eb為各藥單用時(shí)的抑制率，當(dāng)q<0.85時(shí)表示兩藥合用有拮抗作用；q>1.15時(shí)，表示兩藥有協(xié)同作用；當(dāng)0.85

2.6 血清TNF-α和IFN-γ含量測定 第13d動(dòng)物稱重后，無菌條件摘眼球取血，靜置4h，離心并分離血清，置-20℃冰箱備用。采用ELISA雙抗體夾心法測定IFN-γ、TNF-α含量。根據(jù)試劑盒的操作說明，向預(yù)先包被了IFN-γ、TNF-α多克隆抗體的酶標(biāo)孔中加入待測樣品，溫育；洗滌后，依次加入底物A、B,底物(TMB)在辣根過氧化物酶(HRP)催化下轉(zhuǎn)化為藍(lán)色產(chǎn)物，再次在酸的作用下變成黃色，顏色的深淺與樣品中C57小鼠IFN-γ、TNF-α的濃度呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀測定吸光度OD值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算小鼠血清IFN-γ、TNF-α的含量。

3 結(jié)果

3.1 小鼠的一般情況觀察 在實(shí)驗(yàn)前3d，各組右腋下注射部位未觸及包塊。模型組第4d開始，其它荷瘤組第6d始可在注射部位觸及稍突起于皮面的質(zhì)軟腫塊，造模的成功率為100%，皮下腫塊外觀呈球形或半球形，初起可活動(dòng)，逐漸腫塊變硬；腫瘤大小不一，后期部分小鼠腫瘤表面出現(xiàn)局部潰破結(jié)痂。一般情況觀察如下:早期荷瘤C57小鼠身形勻稱，動(dòng)作敏捷，皮毛黑亮，順滑有光澤，緊貼身體，無蓬松零亂，體重增長均勻，進(jìn)食正常；隨著腫瘤的增長，C57小鼠逐漸出現(xiàn)狀態(tài)欠佳，進(jìn)食水量減少，活動(dòng)減少，行動(dòng)遲緩，體重增長緩慢，至后期小鼠因腫瘤過大出現(xiàn)身體消瘦，活動(dòng)遲緩，皮毛稀疏，精神萎靡，而且有脫毛情況。第13d各組陸續(xù)出現(xiàn)荷瘤小鼠死亡，其中模型對照組小鼠死亡出現(xiàn)最早。

3.2 腫瘤體積和腫瘤生長曲線圖 至6d時(shí)，幾乎所有小鼠都有大小不等的腫瘤包塊，造模成功率100%。腫瘤逐漸增大，多數(shù)腫塊為球狀或半球狀，至12d開始，部分小鼠腫瘤因過大出現(xiàn)中央皮膚暗紅并逐漸出現(xiàn)潰爛結(jié)癡，小鼠因腫瘤過大而活動(dòng)受限。12d時(shí)，Model組小鼠平均腫瘤體積明顯大于各觀察組(P<0.05)，提示CTX、青蒿素有一定的抑制腫瘤生長的作用。組間比較：與Model組比較，CTX組、ART+CTX及ART200 mg/kg(P<0.01),有顯著性差異，提示CTX和ART200 mg/kg具有顯著的抑瘤作用。由表所示，隨著ART劑量的增加，腫瘤的體積逐漸縮小，提示ART的抑瘤作用與ART的劑量呈正相關(guān)。見表1和圖1。

表1 各實(shí)驗(yàn)小鼠腫瘤體積比較±s)

圖1 各組小鼠腫瘤生長曲線圖

3.3 腫瘤質(zhì)量和抑瘤率 由表2看出，青蒿素各劑量組對小鼠Lewis移植性肺癌均有顯著的抑瘤作用。ART200mg/kg和100mg/kg劑量組的抑瘤率分別為36.06%、23.84%，CTX組抑瘤率為54.85%，ART聯(lián)合CTX藥物組抑瘤率為61.49%。以上各劑量藥物組與模型對照組比較，除ART25mg/kg組外，均P<0.01有顯著性差異。Model組小鼠腫瘤質(zhì)量為1.506±0.160g，顯著高于其它各組，提示青蒿素的各劑量組和CTX均有抑制Lewis肺癌荷瘤生長的作用。通過金氏公式求得聯(lián)合用藥組q=0.94,說明兩藥有相加作用。

表2 各組小鼠腫瘤質(zhì)量及抑瘤率比較±s)

3.4 青蒿素對小鼠免疫器官的影響 由表3可以看出，CTX組小鼠脾臟和胸腺質(zhì)量有所減輕，且ART聯(lián)合CTX組胸腺重量亦有所減輕(P<0.01)，說明CTX可使小鼠的脾臟和胸腺受到抑制，對機(jī)體有一定的毒害作用。ART200mg/kg組胸腺與Model組比較有所減輕(P<0.05)，提示ART200mg/kg對胸腺有抑制作用。ART100mg/kg和25mg/kg劑量組對小鼠脾臟和胸腺質(zhì)量無顯著性變化，提示青蒿素中低劑量對小鼠胸腺和脾臟免疫器官?zèng)]有損害，且小鼠胸腺和脾臟質(zhì)量都有所增加。

表3 青蒿素對Lewis肺癌小鼠脾臟及胸腺的影響±s)

3.5 青蒿素對Lewis肺癌小鼠血清TNF-α和IFN-γ的影響 由表4可以看出，Lewis肺癌小鼠血清TNF-α量，與Normal組比較，CTX組小鼠TNF-α量為1.018±0.191ng/mL，顯著低于Normal組(P<0.01)，具有顯著性差異，ART200mg/kg組顯著升高，ART100mg/kg和100mg/kg組雖有所升高，但不顯著(P>0.05)；與Model組比較，ART200mg/kg和100mg/kg組小鼠血清TNF-α量升高(P<0.01)，有顯著性差異。Lewis肺癌小鼠血清IFN-γ量，與Normal組比較，ART200mg/kg和100mg/kg組小鼠血清TNF-α量升高顯著(P<0.01)，有顯著性差異；與Model組比較，CTX組和聯(lián)合組有所下降(P<0.05)，有顯著性差異。ART100mg/kg和25mg/kg組升高(P<0.01)，有顯著性差異。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示青蒿素高中劑量組能促進(jìn)TNF-α的產(chǎn)生，且隨著劑量的增大，血清中TNF-α水平顯著提高。青蒿素各劑量組亦能促進(jìn)IFN-γ的產(chǎn)生，但以ART100mg/kg組最為顯著。

表4 青蒿素對Lewis肺癌小鼠血清TNF-α和IFN-γ的影響±s)

4 討論

結(jié)果顯示：青蒿素200mg/kg和100mg/kg劑量組的抑瘤率分別為36.06%、23.84%，青蒿素聯(lián)合CTX藥物組的抑瘤率為61.49%，都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說明青蒿素具有抗Lewis肺癌的作用。在實(shí)驗(yàn)中，免疫器官的臟器質(zhì)量是衡量機(jī)體免疫功能的初步指標(biāo)，與模型對照組比較，雖然青蒿素對Lewis肺癌小鼠的胸腺質(zhì)量和脾臟質(zhì)量無顯著差異，但是小鼠的胸腺和脾臟質(zhì)量都有所增加。而陽性藥物CTX和聯(lián)合用藥組，Lewis肺癌小鼠的胸腺質(zhì)量和脾臟質(zhì)量顯著減少(P<0.01)，推測CTX可使小鼠的脾臟和胸腺受到抑制，對機(jī)體有一定的毒害作用。

近些年來研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中，細(xì)胞因子TNF-α與IFN-γ發(fā)揮著不可忽視的作用。目前TNF-α、IFN-γ可作為腫瘤治療反應(yīng)、治療機(jī)制和治療效果判斷的生物學(xué)指標(biāo)[2]。TNF-α在腫瘤機(jī)體免疫功能中是非常重要的細(xì)胞因子，近年來被用于腫瘤細(xì)胞的凋亡及聯(lián)合化療藥物治療，被認(rèn)為是與腫瘤惡化有關(guān)的細(xì)胞因子，與腫瘤惡病質(zhì)有關(guān)，同時(shí)又是一種免疫調(diào)節(jié)因子，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能作用[3,4]。TNF-α具有直接殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，體現(xiàn)在某些磷脂酶、蛋白酶和核酸酶等，這些酶都是殺傷腫瘤細(xì)胞不可缺少的水解酶。而且，它還可以通過間接作用殺傷腫瘤細(xì)胞，例如阻斷腫瘤細(xì)胞血液供應(yīng)，增加腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的凝血活性，使血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，以及抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移等[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示青蒿素能促進(jìn)TNF-α的產(chǎn)生，而且隨著劑量的增大，血清中TNF-α水平顯著提高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，青蒿素各組均能促進(jìn)IFN-γ的產(chǎn)生，但以高劑量組最為顯著。IFN-γ與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，有抗腫瘤細(xì)胞增殖作用，還有免疫調(diào)節(jié)作用，可介導(dǎo)T細(xì)胞對巨噬細(xì)胞的激活，并能直接增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的殺傷能力；可誘導(dǎo)某些腫瘤細(xì)胞表達(dá)MHC-Ⅱ和MHC-Ⅰ類抗原，促進(jìn)靜止的CD4+T細(xì)胞變化為Th1細(xì)胞，并抑制Th2細(xì)胞的增殖，促進(jìn)CD8+CTL的成熟，增強(qiáng)CD8+CTL和NK細(xì)胞的殺傷活性[6,7]。通過抑制腫瘤細(xì)胞的增生，改變腫瘤細(xì)胞表面的性能及誘發(fā)新的抗原而被免疫監(jiān)視細(xì)胞識別并加以排斥，實(shí)現(xiàn)抗腫瘤效應(yīng)和增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤能力。另外IFN-γ還可通過血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮其抑制腫瘤血管生長的作用[8]。且本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果還顯示，青蒿素對小鼠Lewis肺癌具有顯著的抑制作用，表明青蒿素對動(dòng)物肺癌的抑制與增強(qiáng)荷瘤小鼠細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ的免疫作用密切相關(guān)。

綜上所述，青蒿素不但能顯著抑制小鼠肺癌，而且能影響荷瘤小鼠外周血清TNF-α及IFN-γ細(xì)胞因子水平，從結(jié)果可以看出，隨著其劑量的增加，可使血清中TNF-α的水平明顯提高，而其還能顯著提高血清中IFN-γ的水平。這為臨床使用青蒿素抗癌機(jī)理從細(xì)胞因子水平上提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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