用于多藥耐藥轉運評價的P糖蛋白底物羅丹明123定量方法的建立*

★ 李秀瓊 袁慕榮 孫亞彬 劉思佳

(1.佛山市中醫院藥劑科 廣東 佛山 528000；2.南方醫科大學南方醫院藥物臨床試驗機構 廣東 廣州 510515；3.南方醫科大學南方醫院藥學部 廣東 廣州 510515)

羅丹明123(R123)又稱雙6-氨基3-亞胺基3H-氧雜蒽-9-yl苯甲酸甲酯，其分子式為C21H16N2O3·HCl，相對分子質量為344.4。它是一種發黃綠色熒光的熒光染料，可以根據細胞膜的選擇性來染色活細胞線粒體,廣泛用作檢測線粒體膜電位，也常用于細胞凋亡檢測。另外，R123可以快速通過細胞膜,高度選擇性地聚集在線粒體,并且對細胞沒有任何毒性，同時被多藥耐藥細胞(mμLtidrug resistance ,MDR)有效排出[1-5]。R123是P糖蛋白的一種底物，常用于癌癥研究[4,5]。現在常用檢測R123的方法有：熒光分光光度計[6-8]，高效液相熒光檢測器[9,10]，酶標儀[11]等。

R123作為多藥耐藥性體內評價的指示劑時,通常需要檢測其在血液中的濃度。但是現在還未發現有文章應用LC-MS/MS系統的評價R123在血漿中的檢測方法學，并且考察其提取方法，精密度，靈敏度等。本文建立了用LC-MS/MS檢測血漿中R123濃度的方法學，并保證了分析方法快速，靈敏度高，高選擇性。

1 材料與方法

1.1 試劑 羅丹明123(批號：046K3688)；內標羅丹明6G(批號：1425911V)；甲醇，乙腈均為分析純，購自西格瑪公司(中國上海)。乙酸乙酯，二氯甲烷，碳酸氫鈉均為色譜純，購自CAF公司(中國廣州)。

1.2 裝置 Agilent 1100 Series液相色譜儀；Agilent 6410三重四極桿液相色譜/質譜；Agilent MassHunter色譜管理系統。

1.3 LC-ESI-MS 用Zorbax Eclipse XDB C18column(150mm×3.5mm，5μm；Agilent, Wilmington, DE, USA)在柱溫為40℃時分離血漿中的待測物。流動相為甲酸銨(包含5mM甲酸銨及1%的甲酸)和乙腈(5∶95)，流速為0.5mL/min。自動進樣器的溫度設定為25℃

質譜應用陽離子多重反應器(MRM)。離子噴霧電壓為+3.5kV，發熱氣體溫度為350℃，干燥氣體流速為10L/min。MRM用于數據采集。R123 MRM優化后，離子碎片躍遷m/z 345～285，碰撞能量為44eV。R6G離子碎片躍遷m/z 443～415碰撞能量為41eV。每次躍遷時間為200ms。

1.4 制備標準品及質控(QC)樣品。 精密稱取R123 1mg溶解于甲醇中，制成濃度為1mg/mL的儲備液。將儲備液用甲醇連續稀釋制成工作液濃度：1，2,10,50,100,150,200ng/mL。QC用儲備液用同樣的方法單獨稀釋，濃度分別為2,100,150ng/mL。內標用甲醇配成濃度為1mg/mL的儲備液，并稀釋成50ng/mL。所有溶液均保存于4℃環境中，使用前在室溫中放置。

1.5 血漿樣品的提取 將100μL內標(50ng/mL，用甲醇稀釋)蒸干后加入0.1mL血漿樣品中，然后加入0.1mL飽和碳酸氫鈉，混勻，再加3mL乙酸乙酯/二氯甲烷(4∶1)，混合后斡旋1min，之后3500轉離心10min。上清液轉移至干凈的玻璃試管中，用真空干燥箱揮干。殘渣用200μL流動相復溶，取2μL用于LC-MS/MS分析。

1.6 方法學驗證

1.6.1 選擇性 比較R123及內標分別在空白血漿及空白血漿中添加最低檢出限濃度的R123及濃度為50ng/mL的R6G及體內含藥血漿中的MRM色譜圖，驗證樣品的色譜峰沒有受內源性物質干擾。

1.6.2 標準曲線及最低檢出限(LLOQ) 血漿配置3組標曲工作液，用于擬合標曲。分析物及內標的比值使線性最小加權平方滿足條件后，3組工作液擬合出合適的標曲，并且確定最低檢測限

1.6.3 回收率 檢測2,100,150ng/mL三個濃度的R123的血漿中提取回收率。血漿樣品中均加入等量一定濃度的內標。比較提取血漿后待測樣品的濃度與相對應的原始濃度的比值即為提取回收率。

1.6.4 精密度與準確度 將QC樣品配成三個濃度，并且每個濃度設置15個復孔，驗證此方法學的日間及日內的精密度及準確度。精密度的結果用RSD。準確度用RE%表示。

1.6.5 穩定性 考察含有R123的血液樣本的室溫穩定性，樣本的處理液穩定性，以及反復凍融穩定性。室溫穩定性：室溫條件下放置1 h和24 h后，處理樣本，與新鮮配制的儲備液比較；樣本的處理液穩定性：樣本處理后，1 h和24 h后進樣分析，與新鮮配制的儲備液比較；反復凍融穩定性：凍融1和3次后，處理進樣分析，與新鮮配制的儲備液比較。當貯備液濃度范圍與初始濃度相比在85%與115%之間時，被認為是穩定性良好的。凍融穩定性溫度為-20℃～25℃反復循環。

1.6.6 介質效應 根據Matuszewski[12]的方法，進行介質效應考察。由于實驗中相關介質物質被洗脫出，可能造成介質效應或者潛在的離子效應抑制或者增強。將空白血漿樣品按相同條件提取后，加入已知濃度，與QC樣品的濃度相比。內標的介質效應按相同方法在50ng/mL濃度時進行考察。

2 結果

2.1 色譜條件優化 R123在Q1全掃描模式下，(M+H)離子具有較高的液質響應值，并且沒有觀察到其他的離子出現。子離子掃描時，當CE值為44eV時，R123最大離子碎片為m/z=285。R6G作為R123的結構類似物被用于做內標。R6G在全掃描模式下，母離子躍遷m/z=443。多離子反應監測下，子離子碎片在m/z=415時是穩定的。R123及R6G的質譜圖見圖1，2。

分別考察甲醇與乙腈的流動相PH，緩沖液，組分對保留時間及分離度的影響，發現甲醇對背景的干擾力大于乙腈。選擇甲酸銨(包含5mM甲酸銨及1%的甲酸)和乙腈(20∶80)做為流動相，R123與內標R6G的保留時間分別為2.807，3.15 min。

用乙酸乙酯，甲醇，二氯甲烷(單獨以及聯合用)做為提取溶劑時，提取回收率很低(小于45%或不相容)。當選擇乙酸乙酯做為提取劑使，提取率明顯增高。實驗最終選取乙酸乙酯∶二氯甲烷(4∶1)以及加入飽和碳酸氫鈉，與其他提取劑相比，提取效率最高，并且沒有發現雜峰。

圖1 R123全離子掃描圖譜

圖2 R6G子離子掃描圖譜

2.2 方法學驗證

2.2.1 方法選擇性 從血漿中提取出的R123及R6G的3種典型MRM色譜圖如圖3所示。藥物及內標的色譜圖在各自的保留時間內均沒有內源性基質的干擾。

A.空白血漿；B.空白血漿中添加最低檢出限濃度的R123及濃度為50ng/mL的R6G；C.尾靜脈注射R123 360min后測得的血漿中R123的MRM色譜圖

2.2.2 線性及LLOQ 標準曲線為：Y=1.1575X+0.0027，r=0.9999(n=7)，1ng/mL為最低檢測限。

2.2.3 回收率 R123在三個質控濃度檢測下的提取回收率為87.73%，92.16%及91.23%。而內標的回收率為78.13%。R123及內標的回收率前后一致性良好并且沒有濃度依賴性。

2.2.4 精密度及準確度 表一中總結了所有的相關值。日內精密度分別為6.95%，3.33%，1.41%，日間精密度分別為：9.2%，3.02%，2.09%。準確度范圍為-3.03%～5.26%。

表1 大鼠血漿R123準確度及精密度

相對誤差(%)=[(平均濃度-理論濃度)/理論濃度]×100。2.2.5 穩定性 表2總結了R123的樣品的穩定性，并且沒發現顯著性的分解。數據表明R123是可以在實驗條件下反復保存和提取的。

表2 大鼠血漿中R123的穩定性測定(ng/mL,±s,n=15)

2.2.6 介質效應 R123三個濃度的介質效應分別為：99.89%，99.26%和101.73%。內標的介質效應為101.88%。

3 結論

本文應用LC-MS/MS方法檢測人血漿中R123的濃度。方法的最低檢測限為1ng/mL，濃度范圍為1～200 ng/mL。LC-MS/MS是用于檢測血漿中R123含量的快速且靈敏的方法。

[1]R Yumoto, T Murakami, Y Nakamoto, et al. Transport of rhodamine 123, a P-glycoprotein substrate, across rat intestine and Caco-2 cell monolayers in the presence of cytochrome P-450 3A-related compounds[J].J. Pharmacol. Exp. Ther, 1999 , 289(1):149-55.

[2]N Mizuno, T Niwa, Y Yotsumoto, et al. Impact of drug transporter studies on drug discovery and development[J].Pharmacol. Rev, 2003 ,55(3):425-61.

[3]J W Polli, S A Wring, J E Humphreys, et al. Rational use of in vitro P-glycoprotein assays in drug discovery[J]. J. Pharmacol. Exp. Ther, 2001,299(2):620-8.

[4]P V Balimane, YH Han, S Chong. Current industrial practices of assessing permeability and P-glycoprotein interaction[J].AAPS J, 2006 ,8(1):E1-13.

[5]Eva M. del Amo, Aki T. Heikkinen, Jukka M?nkk?nen. In vitro-in vivo correlation in P-glycoprotein mediated transport in intestinal absorption[J].Eur. J. Pharm. Sci, 2009,36(2-3):200-11.

[6]M Fontaine, W F Elmquist, D W Miller. Use of rhodamine 123 to examine the functional activity of P-glycoprotein in primary cultured brain microvessel endothelial cell monolayers[J].Life Sci, 1996,59(18):1521-31.

[7]G Tramonti, N Romiti, M Norpoth, et al. P-glycoprotein in HK-2 proximal tubule cell line[J].Ren. Fail, 2001 ,23(3-4):331-7.

[8]N Romiti, G Tramonti, E Chieli. Influence of different chemicals on MDR-1 P-glycoprotein expression and activity in the HK-2 proximal tubular cell line[J].Toxicol. Appl. Pharmacol, 2002,183(2):83-91.

[9]R Yumoto, T Murakami, Y Nakamoto, et al. Transport of rhodamine 123, a P-glycoprotein substrate, across rat intestine and Caco-2 cell monolayers in the presence of cytochrome P-450 3A-related compounds[J].J. Pharmacol. Exp. Ther , 1999 ,289(1):149-55.

[10]T Iqbal, M Kinjo, T C Dowling. Determination of Rhodamine 123 in cell lysate by HPLC with visible wavelength detection[J].J. Chromatogr. B, 2005,814(2):259-62.

[11]M Dorababu, A Nishimurab, T Prabha, et al. Effect of cyclosporine on drug transport and pharmacokinetics of nifedipine[J].Biomed. Pharmacother , 2009 ,63(9):697-702.

[12]B K Matuszewski, M L Constanzer, C M Chavez-Eng. Strategies for the Assessment of Matrix Effect in Quantitative Bioanalytical Methods Based on HPLC-MS/MS[J].Anal. Chem,2003, (75):3 019-3 030.