苯海拉明軟膏微生物限度檢查方法的驗證

余曉霞　朱樺　區杰彬

【摘要】 目的 建立苯海拉明軟膏微生物限度檢查方法。 方法 采用常規法進行細菌、霉菌及酵母菌計數方法的驗證和控制菌檢查的驗證。 結果 采用常規法， 細菌、霉菌及酵母菌的回收率均>70%， 并可檢出銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌。 結論 經方法學驗證， 結果符合現行《中國藥典》2010年版的要求。

【關鍵詞】 苯海拉明軟膏；微生物限度；驗證

【Abstract】 Objective To establish a method to test microbial limit in diphenhydramine ointment. Methods Conventional method was adopted to verify bacteria， mold and yeast count method and control bacteria check. Results By conventional method， all of the recoveries of bacteria， mold and yeast were above 70%， pseudomonas aeruginosa and staphylococcus aureus were detected. Conclusion Through the technological validation， the result is consistent with the requirement of “Chinese Pharmacopoeia”（edition 2010） in force.

【Key words】 Diphenhydramine ointment； Microbial limit； Validation

苯海拉明軟膏為中山大學孫逸仙紀念醫院的外用制劑， 其主要成分為鹽酸苯海拉明和黃凡士林， 具有抗過敏、止癢、消炎、消腫作用。2013年廣東省食品藥品監督管理局對醫院制劑提出了標準提高的要求。現根據《中國藥典》2010年版[1]， 對苯海拉明軟膏微生物限度檢查方法進行驗證， 以保證測定結果的可靠性。

1 儀器與材料

1. 1 儀器 HTY-2000B集菌儀（杭州泰林醫療器械廠）、NS01-75D1薄膜過濾器（北京牛牛基因技術有限公司， 批號20121223）、超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司）、303A-1生化培養箱（上海浦東榮豐科學儀器有限公司）、SPX-100B生化培養箱（上海悅豐儀器表有限公司）。

1. 2 試藥 營養瓊脂培養基（批號：121220）， 玫瑰紅鈉瓊脂培養基（批號：130108）， 營養肉湯培養基（批號：121214）， 改良馬丁培養基（批號：130109）， 改良馬丁瓊脂培養基（批號：130109）， 膽鹽乳糖培養基（批號：120309）， 溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基（批號：130215）， 甘露醇氯化鈉瓊脂培養基（批號：130520）（以上均來源于北京三藥科技開發公司）。苯海拉明軟膏（中山大學孫逸仙紀念醫院， 批號：201309118， 201301111， 201401118；規格：30 g）。

1. 3 菌種 大腸埃希菌（Escherichia coli） [CMCC（B）44 102]， 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26 003]， 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis） [CMCC（B）63 501]， 白色念珠菌（Candida albicans） [CMCC（F）98 001]， 黑曲霉（Aspergillus niger） [CMCC（F）98 003]， 銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10 104]（以上菌種的凍干菌均購自中國食品藥品生物檢定研究院）。

2 方法與結果

2. 1 菌液制備

2. 1. 1 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌 取新鮮培養物接種至營養肉湯培養基中， 置30～35℃培養18～24 h；培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成含菌數為50～l00 cfu/ml的菌懸液。

2. 1. 2 白色念珠菌 取新鮮培養物接種至改良馬丁培養基中， 置23～28℃培養24～48 h；培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成含菌數為50～100 cfu/ml的菌懸液。

2. 1. 3 黑曲霉 取新鮮培養物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養基中， 置23～28℃培養5～7 d， 加入3～5 ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液， 將孢子洗脫。然后， 采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內， 用含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成含孢子數50～100 cfu/ml的孢子懸液。

2. 2 供試液制備 取供試品10 g、十四烷酸異丙酯20 ml至含無菌玻璃珠的錐形瓶中， 置45℃水浴中， 充分振搖， 使供試品溶解， 再加入45℃ pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml， 振搖5～10 min， 置45℃水浴保溫、靜置使分層， 取下層作為1：10的供試液。

2. 3 細菌、霉菌及酵母菌計數方法的驗證

2. 3. 1 試驗組 各取1：10供試液、試驗菌液1 ml， 注入同一平皿中， 立即傾注相應瓊脂培養基， 待凝結后， 培養， 每株試驗菌平行制備2個平皿， 測定試驗組的平均菌落數。

2. 3. 2 菌液組 取試驗菌液1 ml， 注入平皿中， 立即傾注相應瓊脂培養基， 待凝結后， 培養， 每株試驗菌平行制備2個平皿， 測定菌液組的平均菌落數。

2. 3. 3 供試品對照組 各取1：10供試液1 ml， 注入平皿中， 立即傾注相應瓊脂培養基， 待凝結后， 培養， 測定供試品對照組的平均菌落數。

2. 3. 4 回收率計算 各菌株回收率（%）=（試驗組的平均菌落數-供試品對照組的平均菌落數）/菌液組的平均菌落數×100%。結果見表1（回收率應不低于70%）。

由表1可知， 用1 ml/皿供試液時， 各菌株的回收率均可達到70%以上， 且3次均能重現試驗結果， 因此本品的細菌、霉菌及酵母菌計數可用平皿法檢查（即1 ml/皿）。

2. 4 控制菌檢查方法的驗證 本品為局部給藥制劑， 根據《中國藥典》2010年版， 控制菌應檢銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌。

2. 4. 1 銅綠假單胞菌檢查法的驗證 分別取1：10供試液10 ml、銅綠假單胞菌菌懸液1 ml， 加至膽鹽乳糖培養基100 ml中， 按銅綠假單胞菌檢查法進行驗證。結果見表2。

2. 4. 2 金黃色葡萄球菌檢查法的驗證 分別取1：10供試液10 ml、金黃色葡萄球菌菌懸液1 ml， 加至營養肉湯培養基100 ml中， 按金黃色葡萄球菌檢查法進行驗證。結果見表2。

由表2可見， 本品可用常規法檢查銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌。

3 討論

同一人工污染菌種及接種量的微生物在不同劑型藥品里可有不同的檢出結果， 一些非水溶性油劑或軟膏劑， 可因其與水難溶， 其中污染的微生物難與培養基成分接觸或因缺氧而可能不生長[2]。因此正確地制備供試液， 使藥品中污染的微生物得以真實反映， 是保證檢驗結果正確可靠的重要前提。

以此次驗證試驗結果為依據， 確定可采用常規法測定苯海拉明軟膏的細菌、霉菌、酵母菌數和控制菌銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌的檢查。

參考文獻

[1] 國家藥典委員會.中國藥典（二部）.北京：中國醫藥科技出版社， 2010.

[2] 馬緒榮， 蘇德模.藥品微生物學檢驗手冊.北京：科學出版社， 2001：56.

[收稿日期：2014-04-28]endprint

【摘要】 目的 建立苯海拉明軟膏微生物限度檢查方法。 方法 采用常規法進行細菌、霉菌及酵母菌計數方法的驗證和控制菌檢查的驗證。 結果 采用常規法， 細菌、霉菌及酵母菌的回收率均>70%， 并可檢出銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌。 結論 經方法學驗證， 結果符合現行《中國藥典》2010年版的要求。

【關鍵詞】 苯海拉明軟膏；微生物限度；驗證

【Abstract】 Objective To establish a method to test microbial limit in diphenhydramine ointment. Methods Conventional method was adopted to verify bacteria， mold and yeast count method and control bacteria check. Results By conventional method， all of the recoveries of bacteria， mold and yeast were above 70%， pseudomonas aeruginosa and staphylococcus aureus were detected. Conclusion Through the technological validation， the result is consistent with the requirement of “Chinese Pharmacopoeia”（edition 2010） in force.

【Key words】 Diphenhydramine ointment； Microbial limit； Validation

苯海拉明軟膏為中山大學孫逸仙紀念醫院的外用制劑， 其主要成分為鹽酸苯海拉明和黃凡士林， 具有抗過敏、止癢、消炎、消腫作用。2013年廣東省食品藥品監督管理局對醫院制劑提出了標準提高的要求。現根據《中國藥典》2010年版[1]， 對苯海拉明軟膏微生物限度檢查方法進行驗證， 以保證測定結果的可靠性。

1 儀器與材料

1. 1 儀器 HTY-2000B集菌儀（杭州泰林醫療器械廠）、NS01-75D1薄膜過濾器（北京牛牛基因技術有限公司， 批號20121223）、超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司）、303A-1生化培養箱（上海浦東榮豐科學儀器有限公司）、SPX-100B生化培養箱（上海悅豐儀器表有限公司）。

1. 2 試藥 營養瓊脂培養基（批號：121220）， 玫瑰紅鈉瓊脂培養基（批號：130108）， 營養肉湯培養基（批號：121214）， 改良馬丁培養基（批號：130109）， 改良馬丁瓊脂培養基（批號：130109）， 膽鹽乳糖培養基（批號：120309）， 溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基（批號：130215）， 甘露醇氯化鈉瓊脂培養基（批號：130520）（以上均來源于北京三藥科技開發公司）。苯海拉明軟膏（中山大學孫逸仙紀念醫院， 批號：201309118， 201301111， 201401118；規格：30 g）。

1. 3 菌種 大腸埃希菌（Escherichia coli） [CMCC（B）44 102]， 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26 003]， 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis） [CMCC（B）63 501]， 白色念珠菌（Candida albicans） [CMCC（F）98 001]， 黑曲霉（Aspergillus niger） [CMCC（F）98 003]， 銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10 104]（以上菌種的凍干菌均購自中國食品藥品生物檢定研究院）。

2 方法與結果

2. 1 菌液制備

2. 1. 1 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌 取新鮮培養物接種至營養肉湯培養基中， 置30～35℃培養18～24 h；培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成含菌數為50～l00 cfu/ml的菌懸液。

2. 1. 2 白色念珠菌 取新鮮培養物接種至改良馬丁培養基中， 置23～28℃培養24～48 h；培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成含菌數為50～100 cfu/ml的菌懸液。

2. 1. 3 黑曲霉 取新鮮培養物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養基中， 置23～28℃培養5～7 d， 加入3～5 ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液， 將孢子洗脫。然后， 采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內， 用含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成含孢子數50～100 cfu/ml的孢子懸液。

2. 2 供試液制備 取供試品10 g、十四烷酸異丙酯20 ml至含無菌玻璃珠的錐形瓶中， 置45℃水浴中， 充分振搖， 使供試品溶解， 再加入45℃ pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml， 振搖5～10 min， 置45℃水浴保溫、靜置使分層， 取下層作為1：10的供試液。

2. 3 細菌、霉菌及酵母菌計數方法的驗證

2. 3. 1 試驗組 各取1：10供試液、試驗菌液1 ml， 注入同一平皿中， 立即傾注相應瓊脂培養基， 待凝結后， 培養， 每株試驗菌平行制備2個平皿， 測定試驗組的平均菌落數。

2. 3. 2 菌液組 取試驗菌液1 ml， 注入平皿中， 立即傾注相應瓊脂培養基， 待凝結后， 培養， 每株試驗菌平行制備2個平皿， 測定菌液組的平均菌落數。

2. 3. 3 供試品對照組 各取1：10供試液1 ml， 注入平皿中， 立即傾注相應瓊脂培養基， 待凝結后， 培養， 測定供試品對照組的平均菌落數。

2. 3. 4 回收率計算 各菌株回收率（%）=（試驗組的平均菌落數-供試品對照組的平均菌落數）/菌液組的平均菌落數×100%。結果見表1（回收率應不低于70%）。

由表1可知， 用1 ml/皿供試液時， 各菌株的回收率均可達到70%以上， 且3次均能重現試驗結果， 因此本品的細菌、霉菌及酵母菌計數可用平皿法檢查（即1 ml/皿）。

2. 4 控制菌檢查方法的驗證 本品為局部給藥制劑， 根據《中國藥典》2010年版， 控制菌應檢銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌。

2. 4. 1 銅綠假單胞菌檢查法的驗證 分別取1：10供試液10 ml、銅綠假單胞菌菌懸液1 ml， 加至膽鹽乳糖培養基100 ml中， 按銅綠假單胞菌檢查法進行驗證。結果見表2。

2. 4. 2 金黃色葡萄球菌檢查法的驗證 分別取1：10供試液10 ml、金黃色葡萄球菌菌懸液1 ml， 加至營養肉湯培養基100 ml中， 按金黃色葡萄球菌檢查法進行驗證。結果見表2。

由表2可見， 本品可用常規法檢查銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌。

3 討論

同一人工污染菌種及接種量的微生物在不同劑型藥品里可有不同的檢出結果， 一些非水溶性油劑或軟膏劑， 可因其與水難溶， 其中污染的微生物難與培養基成分接觸或因缺氧而可能不生長[2]。因此正確地制備供試液， 使藥品中污染的微生物得以真實反映， 是保證檢驗結果正確可靠的重要前提。

以此次驗證試驗結果為依據， 確定可采用常規法測定苯海拉明軟膏的細菌、霉菌、酵母菌數和控制菌銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌的檢查。

參考文獻

[1] 國家藥典委員會.中國藥典（二部）.北京：中國醫藥科技出版社， 2010.

[2] 馬緒榮， 蘇德模.藥品微生物學檢驗手冊.北京：科學出版社， 2001：56.

[收稿日期：2014-04-28]endprint

【摘要】 目的 建立苯海拉明軟膏微生物限度檢查方法。 方法 采用常規法進行細菌、霉菌及酵母菌計數方法的驗證和控制菌檢查的驗證。 結果 采用常規法， 細菌、霉菌及酵母菌的回收率均>70%， 并可檢出銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌。 結論 經方法學驗證， 結果符合現行《中國藥典》2010年版的要求。

【關鍵詞】 苯海拉明軟膏；微生物限度；驗證

【Abstract】 Objective To establish a method to test microbial limit in diphenhydramine ointment. Methods Conventional method was adopted to verify bacteria， mold and yeast count method and control bacteria check. Results By conventional method， all of the recoveries of bacteria， mold and yeast were above 70%， pseudomonas aeruginosa and staphylococcus aureus were detected. Conclusion Through the technological validation， the result is consistent with the requirement of “Chinese Pharmacopoeia”（edition 2010） in force.

【Key words】 Diphenhydramine ointment； Microbial limit； Validation

苯海拉明軟膏為中山大學孫逸仙紀念醫院的外用制劑， 其主要成分為鹽酸苯海拉明和黃凡士林， 具有抗過敏、止癢、消炎、消腫作用。2013年廣東省食品藥品監督管理局對醫院制劑提出了標準提高的要求。現根據《中國藥典》2010年版[1]， 對苯海拉明軟膏微生物限度檢查方法進行驗證， 以保證測定結果的可靠性。

1 儀器與材料

1. 1 儀器 HTY-2000B集菌儀（杭州泰林醫療器械廠）、NS01-75D1薄膜過濾器（北京牛牛基因技術有限公司， 批號20121223）、超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司）、303A-1生化培養箱（上海浦東榮豐科學儀器有限公司）、SPX-100B生化培養箱（上海悅豐儀器表有限公司）。

1. 2 試藥 營養瓊脂培養基（批號：121220）， 玫瑰紅鈉瓊脂培養基（批號：130108）， 營養肉湯培養基（批號：121214）， 改良馬丁培養基（批號：130109）， 改良馬丁瓊脂培養基（批號：130109）， 膽鹽乳糖培養基（批號：120309）， 溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基（批號：130215）， 甘露醇氯化鈉瓊脂培養基（批號：130520）（以上均來源于北京三藥科技開發公司）。苯海拉明軟膏（中山大學孫逸仙紀念醫院， 批號：201309118， 201301111， 201401118；規格：30 g）。

1. 3 菌種 大腸埃希菌（Escherichia coli） [CMCC（B）44 102]， 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26 003]， 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis） [CMCC（B）63 501]， 白色念珠菌（Candida albicans） [CMCC（F）98 001]， 黑曲霉（Aspergillus niger） [CMCC（F）98 003]， 銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10 104]（以上菌種的凍干菌均購自中國食品藥品生物檢定研究院）。

2 方法與結果

2. 1 菌液制備

2. 1. 1 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌 取新鮮培養物接種至營養肉湯培養基中， 置30～35℃培養18～24 h；培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成含菌數為50～l00 cfu/ml的菌懸液。

2. 1. 2 白色念珠菌 取新鮮培養物接種至改良馬丁培養基中， 置23～28℃培養24～48 h；培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成含菌數為50～100 cfu/ml的菌懸液。

2. 1. 3 黑曲霉 取新鮮培養物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養基中， 置23～28℃培養5～7 d， 加入3～5 ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液， 將孢子洗脫。然后， 采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內， 用含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成含孢子數50～100 cfu/ml的孢子懸液。

2. 2 供試液制備 取供試品10 g、十四烷酸異丙酯20 ml至含無菌玻璃珠的錐形瓶中， 置45℃水浴中， 充分振搖， 使供試品溶解， 再加入45℃ pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml， 振搖5～10 min， 置45℃水浴保溫、靜置使分層， 取下層作為1：10的供試液。

2. 3 細菌、霉菌及酵母菌計數方法的驗證

2. 3. 1 試驗組 各取1：10供試液、試驗菌液1 ml， 注入同一平皿中， 立即傾注相應瓊脂培養基， 待凝結后， 培養， 每株試驗菌平行制備2個平皿， 測定試驗組的平均菌落數。

2. 3. 2 菌液組 取試驗菌液1 ml， 注入平皿中， 立即傾注相應瓊脂培養基， 待凝結后， 培養， 每株試驗菌平行制備2個平皿， 測定菌液組的平均菌落數。

2. 3. 3 供試品對照組 各取1：10供試液1 ml， 注入平皿中， 立即傾注相應瓊脂培養基， 待凝結后， 培養， 測定供試品對照組的平均菌落數。

2. 3. 4 回收率計算 各菌株回收率（%）=（試驗組的平均菌落數-供試品對照組的平均菌落數）/菌液組的平均菌落數×100%。結果見表1（回收率應不低于70%）。

由表1可知， 用1 ml/皿供試液時， 各菌株的回收率均可達到70%以上， 且3次均能重現試驗結果， 因此本品的細菌、霉菌及酵母菌計數可用平皿法檢查（即1 ml/皿）。

2. 4 控制菌檢查方法的驗證 本品為局部給藥制劑， 根據《中國藥典》2010年版， 控制菌應檢銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌。

2. 4. 1 銅綠假單胞菌檢查法的驗證 分別取1：10供試液10 ml、銅綠假單胞菌菌懸液1 ml， 加至膽鹽乳糖培養基100 ml中， 按銅綠假單胞菌檢查法進行驗證。結果見表2。

2. 4. 2 金黃色葡萄球菌檢查法的驗證 分別取1：10供試液10 ml、金黃色葡萄球菌菌懸液1 ml， 加至營養肉湯培養基100 ml中， 按金黃色葡萄球菌檢查法進行驗證。結果見表2。

由表2可見， 本品可用常規法檢查銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌。

3 討論

同一人工污染菌種及接種量的微生物在不同劑型藥品里可有不同的檢出結果， 一些非水溶性油劑或軟膏劑， 可因其與水難溶， 其中污染的微生物難與培養基成分接觸或因缺氧而可能不生長[2]。因此正確地制備供試液， 使藥品中污染的微生物得以真實反映， 是保證檢驗結果正確可靠的重要前提。

以此次驗證試驗結果為依據， 確定可采用常規法測定苯海拉明軟膏的細菌、霉菌、酵母菌數和控制菌銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌的檢查。

參考文獻

[1] 國家藥典委員會.中國藥典（二部）.北京：中國醫藥科技出版社， 2010.

[2] 馬緒榮， 蘇德模.藥品微生物學檢驗手冊.北京：科學出版社， 2001：56.

[收稿日期：2014-04-28]endprint