樹頭菜黃酮提取工藝優化及體外抗氧化活性

劉玉芬　夏海濤　顏薇薇

摘要：以80%乙醇為提取溶劑，以樹頭菜（Crateva unilocalaris Buch.）黃酮提取率為指標，在單因素試驗基礎上，用響應面法優化野生樹頭菜黃酮的提取條件，并測定其體外抗氧化活性。結果表明，最佳提取工藝為提取溫度65 ℃、提取時間1.3 h、液料比28∶1（mL∶g）、提取2次，樹頭菜黃酮提取率為0.497%。樹頭菜黃酮具有較強的清除超氧陰離子自由基、羥自由基的能力和還原能力，清除超氧陰離子自由基和羥自由基的IC50分別為0.615、0.415 mg/mL，其抗氧化能力高于抗壞血酸（VC）和叔丁基對苯二酚（TBHQ）。

關鍵詞：樹頭菜（Crateva unilocalaris Buch.）；響應面法；黃酮；抗氧化活性

中圖分類號：S647；Q819 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）13-3145-04

Optimizing Extraction of Flavonoids from Crateva unilocalaris Buch. and Its

Anti-oxidant Activity in Vitro

LIU Yu-fen，XIA Hai-tao，YAN Wei-wei

（College of Chemical Engineering， Huaihai Institute of Technology， Lianyungang 222005， Jiangsu， China）

Abstract： Using 80% ethanol as extraction solvent， the extraction ratio of flavonoids from Crateva unilocalaris Buch. as index， response surface methodology was used to optimize the extraction of flavonoids from Crateva unilocalaris Buch. with single factor experiment. The antioxidant activity in vitro was evaluated by total reducing power assay. The results showed that the optimal extraction conditions were extraction temperature of 65 ℃， extraction time of 1.3 h， liquid-to-material ratio of 28∶1（mL∶g） and repeated extraction number of 2. Under these conditions， the extraction ratio of flavonoids was up to 0.497%. Crateva unilocalaris Buch. flavonoids had excellent reducing power and high abilities to scavenge superoxide anion and hydroxyl free radicals with IC50 values of 0.615 mg/mL and 0.415 mg/mL， respectively. The antioxidant effect of flavonoids from Crateva unilocalaris Buch. were higher than that of VC and TBHQ.

Key words： Crateva unilocalaris Buch.； response surface methodology； flavonoids； antioxidant activity

樹頭菜（Crateva unilocalaris Buch.）是一種營養豐富、口味獨特的野生蔬菜。樹頭菜是山柑科魚木屬的一種喬木，主要分布于海拔1 500 m以下的熱帶、亞熱帶地區[1，2]，生長于平地或山谷林地等，多為野生[3]。它不僅可作為行道綠化樹種，還兼具藥食價值，其根、莖、葉均可入藥，味苦性寒。根具有清熱解毒、舒筋活絡的功效，可治療肝炎、痢疾等疾病；葉具有健胃的功效；可解毒，治爛瘡[4-7]。樹頭菜含有氨基酸、維生素、礦物質、黃酮、糖類等多種生物活性成分[8-10]。目前，對樹頭菜的研究主要以化學成分及分析方法為主。黃酮是一種天然的生物活性物質，具有藥理作用和保健功能[11-14]。本試驗利用響應面法對樹頭菜黃酮的提取工藝條件進行優化，研究樹頭菜黃酮的抗氧化作用，旨在為深入研究樹頭菜的藥理、保健作用和進一步開發利用資源提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樹頭菜嫩莖葉采自連云港市云龍澗風景區，淮海工學院化學工程學院制藥教研室鑒定為山柑科魚木屬植物樹頭菜。將樹頭菜洗凈，在60 ℃下于電熱恒溫鼓風干燥箱中烘干，粉碎，過60目篩。

蘆丁標準品（中國藥品生物制品鑒定所）；抗壞血酸、叔丁基對苯二酚、鄰苯三酚、水楊酸、硫代巴比妥酸、三羥基氨基甲烷、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、硫酸亞鐵、乙醇、石油醚、丙酮、氯仿等其他試劑均為分析純（上海國藥集團試劑公司）。

1.2 儀器與設備

UV-2550型紫外分光光度計（日本島津公司）；RE-5285A型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）；TDL-4型臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樹頭菜黃酮提取工藝 樹頭菜干粉→80%乙醇水溶液提取→離心→濾液→減壓濃縮→提取液定容→測定總黃酮含量。

1.3.2 樹頭菜黃酮提取率的測定 按文獻[15]中的方法測定樹頭菜黃酮的含量。標準曲線回歸方程為A=-0.001 7+0.026 1C，R2=0.999 4。

1.3.3 單因素試驗 分別考察乙醇溶液體積分數（50%、60%、70%、80%、90%）、液料比（20∶1、25∶1、 30∶1、35∶1、40∶1，mL/g，下同）、提取溫度（50、60、70、80 ℃）、提取時間（1.0、1.5、2.0、2.5 h）和顆粒尺寸（20、40、60、80目）對樹頭菜黃酮提取率的影響。

1.3.4 響應面優化試驗 在單因素試驗的基礎上，選取液料比、提取溫度、提取時間為自變量，樹頭菜黃酮提取率為響應值進行響應面優化組合。試驗因素和水平見表1，數據采用Design Expert 8.05 統計軟件進行分析。

1.3.5 樹頭菜黃酮的抗氧化活性測定 參照文獻[16]中的方法測定樹頭菜黃酮的抗氧化活性。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

不同單因素對樹頭菜黃酮提取率的影響結果見圖1至圖5。由圖1至圖5可見，選擇最適宜的條件水平，乙醇溶液體積分數80%，提取時間1.5 h、液料比25∶1、顆粒尺寸60目、提取溫度60 ℃為宜。2.2 響應面優化試驗結果

響應面試驗優化樹頭菜黃酮提取條件的結果見表2。用Design Expert 8.05軟件對表2數據進行分析，得到樹頭菜黃酮提取率對提取時間、提取溫度、液料比的回歸方程：黃酮提取率（Y）=0.497 4-0.005 9A+0.013 6B+0.004 0C+0.005 8AB-0.001 5AC+0.042 0BC-0.005 6A2-0.041 1B2-0.018 8C2。

由表3回歸模型方差分析結果可知，模型項P值小于0.000 1，表明響應回歸模型達到了極顯著水平，失擬項P值0.110 2>0.05，說明該模型可信度高。模型的相關系數R為0.996 0，修正相關系數RAdj為0.990 9，表明樹頭菜黃酮提取率的試驗值和預測值擬合度較高。回歸方程各項的方差分析表明，除方程交互項AC外，其他項對黃酮提取率的影響均達顯著水平。選定的因素對黃酮提取率影響的順序為提取溫度、提取時間、液料比。

由圖6可以看出，各因素交互作用對響應值的影響，當固定液料比為25∶1時，提取時間和溫度的交互作用顯著；當固定提取溫度為60 ℃時，提取時間和液料比的交互作用不顯著；當固定提取時間1.5 h時，提取溫度和液料比的交互作用顯著。因此，在本試驗的范圍內可以通過適當提高提取溫度和液料比來提高黃酮的提取率。

根據所得試驗模型，預測樹頭菜黃酮提取的最優工藝條件為提取時間1.31 h，提取溫度64.69 ℃，液料比28.22∶1，在此條件下黃酮的提取率可達到0.503%。考慮實際情況，將最佳工藝條件修正為提取時間1.3 h、提取溫度65 ℃，液料比28∶1。在修正條件下，實際提取率為0.497%，與理論值接近，說明該模型可用于優化篩選樹頭菜黃酮的提取工藝。

2.3 體外抗氧化試驗結果

圖7至圖9為樹頭菜黃酮的還原能力、羥自由基清除能力和超氧陰離子自由基清除能力結果。由圖7至圖9可見，在各物質質量濃度范圍內，清除率與質量濃度均呈線性關系。由圖8可知，在質量濃度小于0.2 mg/mL時，對羥基自由基的清除能力的大小順序為叔丁基對苯二酚（TBHQ）>樹頭菜黃酮>維生素C；質量濃度大于0.2 mg/mL后，樹頭菜黃酮對羥基自由基的清除能力大于維生素C和TBHQ。其IC50分別為樹頭菜黃酮0.415 mg/mL，維生素C 0.624 mg/mL，TBHQ 0.733 mg/mL。

由圖9可知，在質量濃度小于0.3 mg/mL時，樹頭菜黃酮對超氧陰離子自由基的清除能力低于TBHQ和維生素C；質量濃度大于0.3 mg/mL時，樹頭菜黃酮對超氧陰離子自由基的清除能力大于維生素C和TBHQ。樹頭菜黃酮的IC50為0.615 mg/mL，維生素C的IC50為0.858 mg/mL，TBHQ的IC50為0.929 mg/mL。由此可知，樹頭菜的還原能力、羥自由基清除能力和超氧陰離子自由基清除能力均高于同質量濃度的維生素C和TBHQ。

3 小結

利用響應面法優化樹頭菜黃酮的提取率，得到的最佳提取工藝修正條件為提取溫度65 ℃、提取時間1.3 h、液料比28∶1，樹頭菜黃酮提取率為0.497%。與預測值相比誤差較小，該模型用于優化樹頭菜黃酮的提取工藝準確有效。

樹頭菜黃酮的抗氧化能力在試驗范圍內與質量濃度的關系顯著。與同質量濃度維生素C和TBHQ相比，樹頭菜黃酮的還原能力、羥自由基清除能力和超氧陰離子自由基清除能力均高于維生素C和TBHQ，是一種有效的自由基清除劑，可作為天然抗氧化劑用于食品工業或醫藥領域。

參考文獻：

[1] 徐云鵬，何 禎，董 瓊.樹頭菜無性系扦插生根效果比較[J]. 西南林業大學學報，2011，31（4）：58-60.

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[6] 何 禎，徐云鵬，董 瓊.基質和激素處理對樹頭菜扦插生根的影響[J].山東林業科技，2010（6）：5-7.

[7] 陳文紅，司馬永康，王慷林，等.滇東南的山柑科野生植物種類及其利用價值[J].云南林業科技，2000（3）：23-27.

[8] 董 瓊，何 禎，徐云鵬.不同產地樹頭菜中維生素C含量的測定[J].熱帶農業科學，2011，31（9）：48-50.

[9] 何 禎，何 明，代向陽，等.不同產地樹頭菜中總黃酮含量的測定[J]. 安徽農業科學，2011，39（22）：13398-13399.

[10] 沙 莎，王躍華，高 超，等.野生植物樹頭菜的營養成分分析[J]. 西部林業科學，2008，37（1）：100-102.

[11] 徐方野， 高苗苗. 天然黃酮類化合物的抗腫瘤作用機制研究進展[J]. 新疆醫科大學學報，2013，36（2）：171-176.

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[15] 劉玉芬，夏海濤，楊樹平.紫外分光光度法測定劍麻花中總黃酮的含量[J]. 食品科學，2005，26（9）：418-419.

[16] 劉玉芬， 夏海濤. 響應面法優化堿蒿黃酮提取工藝及其體外抗氧化作用[J]. 食品科學，2012，33（12）：63-68.

1.3.1 樹頭菜黃酮提取工藝 樹頭菜干粉→80%乙醇水溶液提取→離心→濾液→減壓濃縮→提取液定容→測定總黃酮含量。

1.3.2 樹頭菜黃酮提取率的測定 按文獻[15]中的方法測定樹頭菜黃酮的含量。標準曲線回歸方程為A=-0.001 7+0.026 1C，R2=0.999 4。

1.3.3 單因素試驗 分別考察乙醇溶液體積分數（50%、60%、70%、80%、90%）、液料比（20∶1、25∶1、 30∶1、35∶1、40∶1，mL/g，下同）、提取溫度（50、60、70、80 ℃）、提取時間（1.0、1.5、2.0、2.5 h）和顆粒尺寸（20、40、60、80目）對樹頭菜黃酮提取率的影響。

1.3.4 響應面優化試驗 在單因素試驗的基礎上，選取液料比、提取溫度、提取時間為自變量，樹頭菜黃酮提取率為響應值進行響應面優化組合。試驗因素和水平見表1，數據采用Design Expert 8.05 統計軟件進行分析。

1.3.5 樹頭菜黃酮的抗氧化活性測定 參照文獻[16]中的方法測定樹頭菜黃酮的抗氧化活性。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

不同單因素對樹頭菜黃酮提取率的影響結果見圖1至圖5。由圖1至圖5可見，選擇最適宜的條件水平，乙醇溶液體積分數80%，提取時間1.5 h、液料比25∶1、顆粒尺寸60目、提取溫度60 ℃為宜。2.2 響應面優化試驗結果

響應面試驗優化樹頭菜黃酮提取條件的結果見表2。用Design Expert 8.05軟件對表2數據進行分析，得到樹頭菜黃酮提取率對提取時間、提取溫度、液料比的回歸方程：黃酮提取率（Y）=0.497 4-0.005 9A+0.013 6B+0.004 0C+0.005 8AB-0.001 5AC+0.042 0BC-0.005 6A2-0.041 1B2-0.018 8C2。

由表3回歸模型方差分析結果可知，模型項P值小于0.000 1，表明響應回歸模型達到了極顯著水平，失擬項P值0.110 2>0.05，說明該模型可信度高。模型的相關系數R為0.996 0，修正相關系數RAdj為0.990 9，表明樹頭菜黃酮提取率的試驗值和預測值擬合度較高。回歸方程各項的方差分析表明，除方程交互項AC外，其他項對黃酮提取率的影響均達顯著水平。選定的因素對黃酮提取率影響的順序為提取溫度、提取時間、液料比。

由圖6可以看出，各因素交互作用對響應值的影響，當固定液料比為25∶1時，提取時間和溫度的交互作用顯著；當固定提取溫度為60 ℃時，提取時間和液料比的交互作用不顯著；當固定提取時間1.5 h時，提取溫度和液料比的交互作用顯著。因此，在本試驗的范圍內可以通過適當提高提取溫度和液料比來提高黃酮的提取率。

根據所得試驗模型，預測樹頭菜黃酮提取的最優工藝條件為提取時間1.31 h，提取溫度64.69 ℃，液料比28.22∶1，在此條件下黃酮的提取率可達到0.503%。考慮實際情況，將最佳工藝條件修正為提取時間1.3 h、提取溫度65 ℃，液料比28∶1。在修正條件下，實際提取率為0.497%，與理論值接近，說明該模型可用于優化篩選樹頭菜黃酮的提取工藝。

2.3 體外抗氧化試驗結果

圖7至圖9為樹頭菜黃酮的還原能力、羥自由基清除能力和超氧陰離子自由基清除能力結果。由圖7至圖9可見，在各物質質量濃度范圍內，清除率與質量濃度均呈線性關系。由圖8可知，在質量濃度小于0.2 mg/mL時，對羥基自由基的清除能力的大小順序為叔丁基對苯二酚（TBHQ）>樹頭菜黃酮>維生素C；質量濃度大于0.2 mg/mL后，樹頭菜黃酮對羥基自由基的清除能力大于維生素C和TBHQ。其IC50分別為樹頭菜黃酮0.415 mg/mL，維生素C 0.624 mg/mL，TBHQ 0.733 mg/mL。

由圖9可知，在質量濃度小于0.3 mg/mL時，樹頭菜黃酮對超氧陰離子自由基的清除能力低于TBHQ和維生素C；質量濃度大于0.3 mg/mL時，樹頭菜黃酮對超氧陰離子自由基的清除能力大于維生素C和TBHQ。樹頭菜黃酮的IC50為0.615 mg/mL，維生素C的IC50為0.858 mg/mL，TBHQ的IC50為0.929 mg/mL。由此可知，樹頭菜的還原能力、羥自由基清除能力和超氧陰離子自由基清除能力均高于同質量濃度的維生素C和TBHQ。

3 小結

利用響應面法優化樹頭菜黃酮的提取率，得到的最佳提取工藝修正條件為提取溫度65 ℃、提取時間1.3 h、液料比28∶1，樹頭菜黃酮提取率為0.497%。與預測值相比誤差較小，該模型用于優化樹頭菜黃酮的提取工藝準確有效。

樹頭菜黃酮的抗氧化能力在試驗范圍內與質量濃度的關系顯著。與同質量濃度維生素C和TBHQ相比，樹頭菜黃酮的還原能力、羥自由基清除能力和超氧陰離子自由基清除能力均高于維生素C和TBHQ，是一種有效的自由基清除劑，可作為天然抗氧化劑用于食品工業或醫藥領域。

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[10] 沙 莎，王躍華，高 超，等.野生植物樹頭菜的營養成分分析[J]. 西部林業科學，2008，37（1）：100-102.

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[13] 馬 艷.近10年植物中黃酮類化合物的生物活性研究概況[J]. 化工時刊，2012，26（12）：33-35.

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[15] 劉玉芬，夏海濤，楊樹平.紫外分光光度法測定劍麻花中總黃酮的含量[J]. 食品科學，2005，26（9）：418-419.

[16] 劉玉芬， 夏海濤. 響應面法優化堿蒿黃酮提取工藝及其體外抗氧化作用[J]. 食品科學，2012，33（12）：63-68.

1.3.1 樹頭菜黃酮提取工藝 樹頭菜干粉→80%乙醇水溶液提取→離心→濾液→減壓濃縮→提取液定容→測定總黃酮含量。

1.3.2 樹頭菜黃酮提取率的測定 按文獻[15]中的方法測定樹頭菜黃酮的含量。標準曲線回歸方程為A=-0.001 7+0.026 1C，R2=0.999 4。

1.3.3 單因素試驗 分別考察乙醇溶液體積分數（50%、60%、70%、80%、90%）、液料比（20∶1、25∶1、 30∶1、35∶1、40∶1，mL/g，下同）、提取溫度（50、60、70、80 ℃）、提取時間（1.0、1.5、2.0、2.5 h）和顆粒尺寸（20、40、60、80目）對樹頭菜黃酮提取率的影響。

1.3.4 響應面優化試驗 在單因素試驗的基礎上，選取液料比、提取溫度、提取時間為自變量，樹頭菜黃酮提取率為響應值進行響應面優化組合。試驗因素和水平見表1，數據采用Design Expert 8.05 統計軟件進行分析。

1.3.5 樹頭菜黃酮的抗氧化活性測定 參照文獻[16]中的方法測定樹頭菜黃酮的抗氧化活性。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

不同單因素對樹頭菜黃酮提取率的影響結果見圖1至圖5。由圖1至圖5可見，選擇最適宜的條件水平，乙醇溶液體積分數80%，提取時間1.5 h、液料比25∶1、顆粒尺寸60目、提取溫度60 ℃為宜。2.2 響應面優化試驗結果

響應面試驗優化樹頭菜黃酮提取條件的結果見表2。用Design Expert 8.05軟件對表2數據進行分析，得到樹頭菜黃酮提取率對提取時間、提取溫度、液料比的回歸方程：黃酮提取率（Y）=0.497 4-0.005 9A+0.013 6B+0.004 0C+0.005 8AB-0.001 5AC+0.042 0BC-0.005 6A2-0.041 1B2-0.018 8C2。

由表3回歸模型方差分析結果可知，模型項P值小于0.000 1，表明響應回歸模型達到了極顯著水平，失擬項P值0.110 2>0.05，說明該模型可信度高。模型的相關系數R為0.996 0，修正相關系數RAdj為0.990 9，表明樹頭菜黃酮提取率的試驗值和預測值擬合度較高。回歸方程各項的方差分析表明，除方程交互項AC外，其他項對黃酮提取率的影響均達顯著水平。選定的因素對黃酮提取率影響的順序為提取溫度、提取時間、液料比。

由圖6可以看出，各因素交互作用對響應值的影響，當固定液料比為25∶1時，提取時間和溫度的交互作用顯著；當固定提取溫度為60 ℃時，提取時間和液料比的交互作用不顯著；當固定提取時間1.5 h時，提取溫度和液料比的交互作用顯著。因此，在本試驗的范圍內可以通過適當提高提取溫度和液料比來提高黃酮的提取率。

根據所得試驗模型，預測樹頭菜黃酮提取的最優工藝條件為提取時間1.31 h，提取溫度64.69 ℃，液料比28.22∶1，在此條件下黃酮的提取率可達到0.503%。考慮實際情況，將最佳工藝條件修正為提取時間1.3 h、提取溫度65 ℃，液料比28∶1。在修正條件下，實際提取率為0.497%，與理論值接近，說明該模型可用于優化篩選樹頭菜黃酮的提取工藝。

2.3 體外抗氧化試驗結果

圖7至圖9為樹頭菜黃酮的還原能力、羥自由基清除能力和超氧陰離子自由基清除能力結果。由圖7至圖9可見，在各物質質量濃度范圍內，清除率與質量濃度均呈線性關系。由圖8可知，在質量濃度小于0.2 mg/mL時，對羥基自由基的清除能力的大小順序為叔丁基對苯二酚（TBHQ）>樹頭菜黃酮>維生素C；質量濃度大于0.2 mg/mL后，樹頭菜黃酮對羥基自由基的清除能力大于維生素C和TBHQ。其IC50分別為樹頭菜黃酮0.415 mg/mL，維生素C 0.624 mg/mL，TBHQ 0.733 mg/mL。

由圖9可知，在質量濃度小于0.3 mg/mL時，樹頭菜黃酮對超氧陰離子自由基的清除能力低于TBHQ和維生素C；質量濃度大于0.3 mg/mL時，樹頭菜黃酮對超氧陰離子自由基的清除能力大于維生素C和TBHQ。樹頭菜黃酮的IC50為0.615 mg/mL，維生素C的IC50為0.858 mg/mL，TBHQ的IC50為0.929 mg/mL。由此可知，樹頭菜的還原能力、羥自由基清除能力和超氧陰離子自由基清除能力均高于同質量濃度的維生素C和TBHQ。

3 小結

利用響應面法優化樹頭菜黃酮的提取率，得到的最佳提取工藝修正條件為提取溫度65 ℃、提取時間1.3 h、液料比28∶1，樹頭菜黃酮提取率為0.497%。與預測值相比誤差較小，該模型用于優化樹頭菜黃酮的提取工藝準確有效。

樹頭菜黃酮的抗氧化能力在試驗范圍內與質量濃度的關系顯著。與同質量濃度維生素C和TBHQ相比，樹頭菜黃酮的還原能力、羥自由基清除能力和超氧陰離子自由基清除能力均高于維生素C和TBHQ，是一種有效的自由基清除劑，可作為天然抗氧化劑用于食品工業或醫藥領域。

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