大豆根際解磷細(xì)菌的分離及篩選

李麗麗等

摘要：解磷菌對(duì)于提高土壤中可溶性磷的含量、促進(jìn)植物對(duì)磷的吸收具有重要作用。利用PVK培養(yǎng)基對(duì)黑龍江省海倫、北安地區(qū)大豆根際土壤中的解磷細(xì)菌進(jìn)行初篩，共分離得到8株具有解無(wú)機(jī)磷能力的菌株。利用NBRIP培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，培養(yǎng)3 d后，根據(jù)搖瓶中上清液的可溶性磷量的高低，篩選出5株解磷能力較強(qiáng)的菌株。其中海倫Ⅳ號(hào)的解無(wú)機(jī)磷能力最強(qiáng)，其培養(yǎng)液上清中的溶磷量可提高約10倍。研究中的技術(shù)體系可有效獲得溶磷的細(xì)菌菌株，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)細(xì)菌磷肥打下了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：解磷細(xì)菌；溶磷量測(cè)定；大豆

中圖分類(lèi)號(hào)： S154.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）13-3048-03

Isolation and Screening of Phosphate-solubilizing in the Rhizosphere of Soybean

LI Li-li1，2，3，LANG Jing4，YANG Hong-yi4，TAI Fei-fei4，LAI Yong-cai1

（1.Crop Tillage and Cultivation Institute， Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Harbin 150086，China；

2. Northeast Forestry University Postdoctoral Programme， Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences Postdoctoral Programme， Harbin 150040，China； 3. Institute of Forestry Science of Heilongjiang Province， Harbin 150081，China；

4.College of Life Science， Northeast Forestry University， Harbin 150040，China）

Abstract：The phosphate-solubilizing bacteria in the soil play an important role for improving the phosphorus level in the soil and absorbing the phosphorus nutrition for plants. The phosphate-solubilizing bacteria （PSB） in the rhizosphere of soybean was isolated using modified PVK medium. Eight strains of PSB were isolated. Subsequently， 5 strains of high-effective PSB were isolated according to phosphorus level in supernatant of culture solution after 3-day incubation in a liquid medium NBRIP. Hailun Ⅳ was found to possess the highest phosphate-solubilizing ability among 5 strains under the screening conditions. The soluble P in the supernatant of the culture of Hailun Ⅳ increased about 10-fold. The screening system can efficiently obtain PSB and is helpful to develop PSB phosphorus fertilizer.

Key words： phosphate-solubilizing bacteria； determination of phosphorus content； soybean

某些微生物可將土壤中難溶性磷轉(zhuǎn)化為植物可以吸收利用的有效磷，這些微生物被稱(chēng)為解磷微生物，其可提高土壤中磷的利用率，促進(jìn)作物生長(zhǎng)。此外，解磷微生物與植物根系分泌物有著密切關(guān)系，可以影響植物根系分泌，改善和緩解根際酸化等問(wèn)題，使植物能適應(yīng)不良環(huán)境[1]。因而開(kāi)發(fā)以解磷微生物為基礎(chǔ)的微生物肥料，可解決化學(xué)磷肥使用帶來(lái)的環(huán)境污染問(wèn)題，促進(jìn)糧食增產(chǎn)。

早在二十世紀(jì)初，歐洲就相繼有人研究了土壤中微生物轉(zhuǎn)化磷的機(jī)制。1935年前蘇聯(lián)學(xué)者蒙基娜從土壤中分離到一種巨大芽孢桿菌，能分解核酸和卵磷脂，在十幾年后該菌株被大量生產(chǎn)并廣泛應(yīng)用于前蘇聯(lián)和東歐各國(guó)[2]。20世紀(jì)50年代，中國(guó)從東北黑土和灰化土中分離出能分解有機(jī)磷的巨大芽孢桿菌。1950年，中國(guó)科學(xué)院前林業(yè)土壤研究所從東北黑土中分離出一株假單胞菌，后期相繼開(kāi)展了小規(guī)模應(yīng)用增產(chǎn)研究[1]。陳華癸、劉榮昌等都曾分離到過(guò)解磷效果較好的菌株，后續(xù)進(jìn)行了大田試驗(yàn)，增肥增產(chǎn)效果較明顯[2]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)較多科研單位在玉米、水稻、大豆等作物上開(kāi)展了大規(guī)模解磷菌的篩選工作。

本研究采集黑龍江省北安和海倫地區(qū)的大豆根際土壤，制備土壤懸液，利用PVK培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行涂布分離和劃線(xiàn)純化，之后利用NBRIP培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)復(fù)篩，最終篩選出高效解磷菌株，為大豆生物磷肥的制備奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

采用“抖根法”采集海倫、北安地區(qū)大豆根際土壤樣品，將采集的土壤置于無(wú)菌袋內(nèi)，置于冰箱冷藏保存。

1.2 解磷菌初篩

取10 g大豆根際土壤，與100 mL去離子水混勻。取上清液，稀釋10倍，涂布于PVK平板[葡萄糖10 g，Ca3（PO4）25 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.1 g，MgSO4 0.1 g，KCl 0.2 g，MnSO4 0.002 g，F(xiàn)eSO4 0.002 g，酵母浸膏0.5 g，0.4% 溴酚藍(lán)（pH 6.7）6 mL，瓊脂18 g，去離子水定容1 000 mL）][3]。倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對(duì)長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行單菌落分離、劃線(xiàn)培養(yǎng)純化，劃線(xiàn)傳代培養(yǎng)5次。

1.3 含磷量測(cè)定

利用鉬藍(lán)比色法測(cè)量溶液中的含磷量，其原理是：在酸性的介質(zhì)中，活性磷酸鹽與鉬酸銨生成鉬酸黃，用抗壞血酸還原為磷鉬藍(lán)后，在882 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，此吸光度與活性磷含量成正比[4]。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：分別取0、0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0 mL的3 μg/mL磷酸鹽工作液置于離心管中，將其稀釋至25 mL，然后加入1.5 mL的抗壞血酸和1.5 mL的鉬酸銨-酒石酸銻鉀，反應(yīng)6 min后，利用分光光度計(jì)測(cè)定吸光值，記錄數(shù)據(jù)。以濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[4]。

1.4 解磷菌的復(fù)篩

利用鉬藍(lán)比色法繪制可溶性磷的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，對(duì)搖瓶培養(yǎng)后獲得的培養(yǎng)液的上清液進(jìn)行同樣的鉬藍(lán)顯色試驗(yàn)，根據(jù)吸光度值的大小與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的公式換算得出磷濃度。取10 mL搖瓶培養(yǎng)3 d的NBRIP液體培養(yǎng)基[葡萄糖 10 g，Ca3（PO4）2 5 g，KCl 0.2 g，（NH4）2SO4 0.1 g，MgSO4 0.25 g，MgCl 5 g，去離子水定容1 000 mL]，置于50 mL離心管中，7 000 r/min離心10 min，每個(gè)離心管取上清液5 μL，用去離子水稀釋到25 mL，設(shè)3個(gè)平行樣。加入1.5 mL的鉬酸銨-酒石酸銻鉀混合溶液和1.5 mL的抗壞血酸，反應(yīng)5 min，測(cè)其吸光度。每個(gè)樣測(cè)3個(gè)平行值，記錄數(shù)據(jù)，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的公式，換算出相應(yīng)的可溶性磷的濃度。將解磷效果較好的菌株用去離子水稀釋20倍，吸取100 μL涂布于PVK平板，長(zhǎng)出單菌落后進(jìn)行菌種保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 PVK平板初篩

利用PVK平板，從北安和海倫大豆根際土樣中共篩選得到8株菌株，這些菌株的溶磷圈均較大，但菌落外觀(guān)形態(tài)有所差異，其透明圈均為無(wú)色。分別編號(hào)為北安Ⅰ、北安Ⅱ、北安Ⅲ、北安Ⅳ、海倫Ⅰ、海倫Ⅱ、海倫Ⅲ、海倫Ⅳ。

對(duì)不同菌株的菌落半徑（d）、透明圈半徑（D）進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算透明圈半徑與菌落半徑的比值（表1）。由表1可知，北安Ⅲ號(hào)的D/d值最高，北安Ⅰ號(hào)的D/d值其次，海倫Ⅳ號(hào)的D/d值最低。根據(jù)篩選原理[5]，在該種篩選條件下，北安Ⅲ號(hào)的解磷能力可能最高，而海倫Ⅳ號(hào)的解磷能力可能最低。

2.2 NBRIP培養(yǎng)基搖瓶復(fù)篩

在NBRIP培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)過(guò)程中，不同菌株生長(zhǎng)及解磷速度差異較大。經(jīng)2 d培養(yǎng)，多數(shù)菌株培養(yǎng)液整體渾濁，但也有少數(shù)菌株培養(yǎng)液較清澈，蜂窩狀的磷顆粒處于培養(yǎng)基底部，但經(jīng)再培養(yǎng)1 d后，所有菌株培養(yǎng)液皆整體渾濁。

解磷細(xì)菌具有解磷效應(yīng)，將其接種到NBRIP培養(yǎng)基，解磷細(xì)菌會(huì)將培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)磷分解為可溶性磷。如果接種入NBRIP培養(yǎng)基的菌種能在這種條件下具備解磷能力，則在培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基中可溶性磷的含量會(huì)上升。可溶性磷的含量上升的越多，其相應(yīng)的菌種的解磷能力則越強(qiáng)。基于鉬藍(lán)比色法，獲得了可溶性磷含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（圖1）。將初篩得到8個(gè)菌株接種入NBRIP培養(yǎng)基，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，基于可溶性磷含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)吸光度換算出可溶性磷含量，不同菌株接種前后的可溶性磷含量見(jiàn)表2。根據(jù)培養(yǎng)液上清液中可溶性磷含量的增加量的大小，從8個(gè)菌株中篩選出5個(gè)培養(yǎng)液中可溶性磷含量較高的菌株。分別是北安Ⅰ號(hào)、北安Ⅲ號(hào)、海倫Ⅱ號(hào)、海倫Ⅲ號(hào)、海倫Ⅳ號(hào)。其中海倫Ⅳ號(hào)的解磷能力最強(qiáng)，在100 mL的NBRIP培養(yǎng)基中，可溶性磷含量增加了431.045～735.397 mg/L，平行樣1大約是原來(lái)的可溶性磷含量的11倍。海倫Ⅱ號(hào)、海倫Ⅲ號(hào)、北安Ⅰ號(hào)、北安Ⅲ號(hào)的解磷能力也較強(qiáng)，可溶性磷含量最高增加超過(guò)200 mg/L。

3 小結(jié)與討論

傳統(tǒng)PVK平板篩選解磷微生物法是根據(jù)篩選平板上生長(zhǎng)的菌落周?chē)欠癞a(chǎn)生透明圈以及透明圈的大小來(lái)判斷菌株是否具有解磷能力，以解磷能力大小來(lái)進(jìn)行解磷微生物的分離和篩選[6]。由于該方法是建立在解磷菌株產(chǎn)酸的前提條件下，因此只有通過(guò)產(chǎn)酸機(jī)制了解解磷微生物，并且必須是能產(chǎn)生大量有機(jī)酸的解磷微生物才有可能被篩選出來(lái)[7]。由于不同微生物間產(chǎn)酸營(yíng)養(yǎng)條件存在差異，所以采用此方法篩選到的可能是只適合在該條件下產(chǎn)酸的微生物，透明圈的大小也僅反映出篩選菌株產(chǎn)有機(jī)酸的能力，不能真實(shí)地反映菌株實(shí)際的解磷能力，也由此反映出如果僅采用PVK平板篩選法來(lái)研究土壤環(huán)境中的解磷微生物群落或確定某一解磷微生物菌株解磷能力的大小會(huì)存在很大的片面性。本研究中經(jīng)初篩獲得的菌株較少，可能與此有關(guān)。

在篩選過(guò)程中，總體上初篩和復(fù)篩的相關(guān)性較強(qiáng)，即菌株在初篩中的溶磷圈較大，其在復(fù)篩中的溶磷效果也較強(qiáng)。但海倫Ⅳ號(hào)菌株在初篩過(guò)程中的溶磷圈最小，而在復(fù)篩中的溶磷效果很好，可能是由于該菌株在不同的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)代謝條件不同，即對(duì)培養(yǎng)條件和解磷對(duì)象有一定的專(zhuān)一性，以至于其解磷能力因培養(yǎng)環(huán)境的不同而不同。

在復(fù)篩過(guò)程中，菌株在NBRIP培養(yǎng)基中培養(yǎng)了3 d，之后進(jìn)行測(cè)量可溶性磷量，但菌液中的可溶性磷含量可能并非皆在第二天達(dá)到頂峰。因而，對(duì)培養(yǎng)液內(nèi)的磷含量進(jìn)行7 d的監(jiān)測(cè)并制備監(jiān)測(cè)曲線(xiàn)，可對(duì)溶磷動(dòng)態(tài)變化有更好的了解。總體上來(lái)看，經(jīng)PVK平板初篩、NBRIP搖瓶復(fù)篩，該技術(shù)體系獲得了可有效溶磷的細(xì)菌菌株，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)細(xì)菌磷肥打下了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李曉婷.磷細(xì)菌K3的GFP標(biāo)記與在土壤中定殖及對(duì)玉米生長(zhǎng)效應(yīng)研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[2] 馮月紅.苜蓿和小麥根際高效解磷細(xì)菌篩選及其溶磷效果的初步研究[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

[3] LIU H， WU X， REN J， et al. Isolation and identification of phosphobacteria in poplar rhizosphere from different regions of China[J]. Pedosphere，2011，21（1）：90-97.

[4] 馬 文.鉬藍(lán)法測(cè)定玉米漿中磷含量[J]. 安徽大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1996（1）：123-126.

[5] 王英健.解磷細(xì)菌的分離純化鑒定與生物學(xué)特性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（32）：13932-13933.

[6] PIKOVSKAYA R I. Mobilization of phosphates in soil in connection with the vital activities of some microbial species[J]. Mikrobiologiya， USSR，1948，17：362-370.

[7] 李文紅，施積炎.西湖沉積物中解磷菌的分離純化及其解磷能力[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2006，17（11）：2112-2116.

1.2 解磷菌初篩

取10 g大豆根際土壤，與100 mL去離子水混勻。取上清液，稀釋10倍，涂布于PVK平板[葡萄糖10 g，Ca3（PO4）25 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.1 g，MgSO4 0.1 g，KCl 0.2 g，MnSO4 0.002 g，F(xiàn)eSO4 0.002 g，酵母浸膏0.5 g，0.4% 溴酚藍(lán)（pH 6.7）6 mL，瓊脂18 g，去離子水定容1 000 mL）][3]。倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對(duì)長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行單菌落分離、劃線(xiàn)培養(yǎng)純化，劃線(xiàn)傳代培養(yǎng)5次。

1.3 含磷量測(cè)定

利用鉬藍(lán)比色法測(cè)量溶液中的含磷量，其原理是：在酸性的介質(zhì)中，活性磷酸鹽與鉬酸銨生成鉬酸黃，用抗壞血酸還原為磷鉬藍(lán)后，在882 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，此吸光度與活性磷含量成正比[4]。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：分別取0、0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0 mL的3 μg/mL磷酸鹽工作液置于離心管中，將其稀釋至25 mL，然后加入1.5 mL的抗壞血酸和1.5 mL的鉬酸銨-酒石酸銻鉀，反應(yīng)6 min后，利用分光光度計(jì)測(cè)定吸光值，記錄數(shù)據(jù)。以濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[4]。

1.4 解磷菌的復(fù)篩

利用鉬藍(lán)比色法繪制可溶性磷的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，對(duì)搖瓶培養(yǎng)后獲得的培養(yǎng)液的上清液進(jìn)行同樣的鉬藍(lán)顯色試驗(yàn)，根據(jù)吸光度值的大小與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的公式換算得出磷濃度。取10 mL搖瓶培養(yǎng)3 d的NBRIP液體培養(yǎng)基[葡萄糖 10 g，Ca3（PO4）2 5 g，KCl 0.2 g，（NH4）2SO4 0.1 g，MgSO4 0.25 g，MgCl 5 g，去離子水定容1 000 mL]，置于50 mL離心管中，7 000 r/min離心10 min，每個(gè)離心管取上清液5 μL，用去離子水稀釋到25 mL，設(shè)3個(gè)平行樣。加入1.5 mL的鉬酸銨-酒石酸銻鉀混合溶液和1.5 mL的抗壞血酸，反應(yīng)5 min，測(cè)其吸光度。每個(gè)樣測(cè)3個(gè)平行值，記錄數(shù)據(jù)，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的公式，換算出相應(yīng)的可溶性磷的濃度。將解磷效果較好的菌株用去離子水稀釋20倍，吸取100 μL涂布于PVK平板，長(zhǎng)出單菌落后進(jìn)行菌種保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 PVK平板初篩

利用PVK平板，從北安和海倫大豆根際土樣中共篩選得到8株菌株，這些菌株的溶磷圈均較大，但菌落外觀(guān)形態(tài)有所差異，其透明圈均為無(wú)色。分別編號(hào)為北安Ⅰ、北安Ⅱ、北安Ⅲ、北安Ⅳ、海倫Ⅰ、海倫Ⅱ、海倫Ⅲ、海倫Ⅳ。

對(duì)不同菌株的菌落半徑（d）、透明圈半徑（D）進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算透明圈半徑與菌落半徑的比值（表1）。由表1可知，北安Ⅲ號(hào)的D/d值最高，北安Ⅰ號(hào)的D/d值其次，海倫Ⅳ號(hào)的D/d值最低。根據(jù)篩選原理[5]，在該種篩選條件下，北安Ⅲ號(hào)的解磷能力可能最高，而海倫Ⅳ號(hào)的解磷能力可能最低。

2.2 NBRIP培養(yǎng)基搖瓶復(fù)篩

在NBRIP培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)過(guò)程中，不同菌株生長(zhǎng)及解磷速度差異較大。經(jīng)2 d培養(yǎng)，多數(shù)菌株培養(yǎng)液整體渾濁，但也有少數(shù)菌株培養(yǎng)液較清澈，蜂窩狀的磷顆粒處于培養(yǎng)基底部，但經(jīng)再培養(yǎng)1 d后，所有菌株培養(yǎng)液皆整體渾濁。

解磷細(xì)菌具有解磷效應(yīng)，將其接種到NBRIP培養(yǎng)基，解磷細(xì)菌會(huì)將培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)磷分解為可溶性磷。如果接種入NBRIP培養(yǎng)基的菌種能在這種條件下具備解磷能力，則在培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基中可溶性磷的含量會(huì)上升。可溶性磷的含量上升的越多，其相應(yīng)的菌種的解磷能力則越強(qiáng)。基于鉬藍(lán)比色法，獲得了可溶性磷含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（圖1）。將初篩得到8個(gè)菌株接種入NBRIP培養(yǎng)基，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，基于可溶性磷含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)吸光度換算出可溶性磷含量，不同菌株接種前后的可溶性磷含量見(jiàn)表2。根據(jù)培養(yǎng)液上清液中可溶性磷含量的增加量的大小，從8個(gè)菌株中篩選出5個(gè)培養(yǎng)液中可溶性磷含量較高的菌株。分別是北安Ⅰ號(hào)、北安Ⅲ號(hào)、海倫Ⅱ號(hào)、海倫Ⅲ號(hào)、海倫Ⅳ號(hào)。其中海倫Ⅳ號(hào)的解磷能力最強(qiáng)，在100 mL的NBRIP培養(yǎng)基中，可溶性磷含量增加了431.045～735.397 mg/L，平行樣1大約是原來(lái)的可溶性磷含量的11倍。海倫Ⅱ號(hào)、海倫Ⅲ號(hào)、北安Ⅰ號(hào)、北安Ⅲ號(hào)的解磷能力也較強(qiáng)，可溶性磷含量最高增加超過(guò)200 mg/L。

3 小結(jié)與討論

傳統(tǒng)PVK平板篩選解磷微生物法是根據(jù)篩選平板上生長(zhǎng)的菌落周?chē)欠癞a(chǎn)生透明圈以及透明圈的大小來(lái)判斷菌株是否具有解磷能力，以解磷能力大小來(lái)進(jìn)行解磷微生物的分離和篩選[6]。由于該方法是建立在解磷菌株產(chǎn)酸的前提條件下，因此只有通過(guò)產(chǎn)酸機(jī)制了解解磷微生物，并且必須是能產(chǎn)生大量有機(jī)酸的解磷微生物才有可能被篩選出來(lái)[7]。由于不同微生物間產(chǎn)酸營(yíng)養(yǎng)條件存在差異，所以采用此方法篩選到的可能是只適合在該條件下產(chǎn)酸的微生物，透明圈的大小也僅反映出篩選菌株產(chǎn)有機(jī)酸的能力，不能真實(shí)地反映菌株實(shí)際的解磷能力，也由此反映出如果僅采用PVK平板篩選法來(lái)研究土壤環(huán)境中的解磷微生物群落或確定某一解磷微生物菌株解磷能力的大小會(huì)存在很大的片面性。本研究中經(jīng)初篩獲得的菌株較少，可能與此有關(guān)。

在篩選過(guò)程中，總體上初篩和復(fù)篩的相關(guān)性較強(qiáng)，即菌株在初篩中的溶磷圈較大，其在復(fù)篩中的溶磷效果也較強(qiáng)。但海倫Ⅳ號(hào)菌株在初篩過(guò)程中的溶磷圈最小，而在復(fù)篩中的溶磷效果很好，可能是由于該菌株在不同的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)代謝條件不同，即對(duì)培養(yǎng)條件和解磷對(duì)象有一定的專(zhuān)一性，以至于其解磷能力因培養(yǎng)環(huán)境的不同而不同。

在復(fù)篩過(guò)程中，菌株在NBRIP培養(yǎng)基中培養(yǎng)了3 d，之后進(jìn)行測(cè)量可溶性磷量，但菌液中的可溶性磷含量可能并非皆在第二天達(dá)到頂峰。因而，對(duì)培養(yǎng)液內(nèi)的磷含量進(jìn)行7 d的監(jiān)測(cè)并制備監(jiān)測(cè)曲線(xiàn)，可對(duì)溶磷動(dòng)態(tài)變化有更好的了解。總體上來(lái)看，經(jīng)PVK平板初篩、NBRIP搖瓶復(fù)篩，該技術(shù)體系獲得了可有效溶磷的細(xì)菌菌株，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)細(xì)菌磷肥打下了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李曉婷.磷細(xì)菌K3的GFP標(biāo)記與在土壤中定殖及對(duì)玉米生長(zhǎng)效應(yīng)研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[2] 馮月紅.苜蓿和小麥根際高效解磷細(xì)菌篩選及其溶磷效果的初步研究[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

[3] LIU H， WU X， REN J， et al. Isolation and identification of phosphobacteria in poplar rhizosphere from different regions of China[J]. Pedosphere，2011，21（1）：90-97.

[4] 馬 文.鉬藍(lán)法測(cè)定玉米漿中磷含量[J]. 安徽大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1996（1）：123-126.

[5] 王英健.解磷細(xì)菌的分離純化鑒定與生物學(xué)特性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（32）：13932-13933.

[6] PIKOVSKAYA R I. Mobilization of phosphates in soil in connection with the vital activities of some microbial species[J]. Mikrobiologiya， USSR，1948，17：362-370.

[7] 李文紅，施積炎.西湖沉積物中解磷菌的分離純化及其解磷能力[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2006，17（11）：2112-2116.

1.2 解磷菌初篩

取10 g大豆根際土壤，與100 mL去離子水混勻。取上清液，稀釋10倍，涂布于PVK平板[葡萄糖10 g，Ca3（PO4）25 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.1 g，MgSO4 0.1 g，KCl 0.2 g，MnSO4 0.002 g，F(xiàn)eSO4 0.002 g，酵母浸膏0.5 g，0.4% 溴酚藍(lán)（pH 6.7）6 mL，瓊脂18 g，去離子水定容1 000 mL）][3]。倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對(duì)長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行單菌落分離、劃線(xiàn)培養(yǎng)純化，劃線(xiàn)傳代培養(yǎng)5次。

1.3 含磷量測(cè)定

利用鉬藍(lán)比色法測(cè)量溶液中的含磷量，其原理是：在酸性的介質(zhì)中，活性磷酸鹽與鉬酸銨生成鉬酸黃，用抗壞血酸還原為磷鉬藍(lán)后，在882 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，此吸光度與活性磷含量成正比[4]。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：分別取0、0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0 mL的3 μg/mL磷酸鹽工作液置于離心管中，將其稀釋至25 mL，然后加入1.5 mL的抗壞血酸和1.5 mL的鉬酸銨-酒石酸銻鉀，反應(yīng)6 min后，利用分光光度計(jì)測(cè)定吸光值，記錄數(shù)據(jù)。以濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[4]。

1.4 解磷菌的復(fù)篩

利用鉬藍(lán)比色法繪制可溶性磷的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，對(duì)搖瓶培養(yǎng)后獲得的培養(yǎng)液的上清液進(jìn)行同樣的鉬藍(lán)顯色試驗(yàn)，根據(jù)吸光度值的大小與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的公式換算得出磷濃度。取10 mL搖瓶培養(yǎng)3 d的NBRIP液體培養(yǎng)基[葡萄糖 10 g，Ca3（PO4）2 5 g，KCl 0.2 g，（NH4）2SO4 0.1 g，MgSO4 0.25 g，MgCl 5 g，去離子水定容1 000 mL]，置于50 mL離心管中，7 000 r/min離心10 min，每個(gè)離心管取上清液5 μL，用去離子水稀釋到25 mL，設(shè)3個(gè)平行樣。加入1.5 mL的鉬酸銨-酒石酸銻鉀混合溶液和1.5 mL的抗壞血酸，反應(yīng)5 min，測(cè)其吸光度。每個(gè)樣測(cè)3個(gè)平行值，記錄數(shù)據(jù)，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的公式，換算出相應(yīng)的可溶性磷的濃度。將解磷效果較好的菌株用去離子水稀釋20倍，吸取100 μL涂布于PVK平板，長(zhǎng)出單菌落后進(jìn)行菌種保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 PVK平板初篩

利用PVK平板，從北安和海倫大豆根際土樣中共篩選得到8株菌株，這些菌株的溶磷圈均較大，但菌落外觀(guān)形態(tài)有所差異，其透明圈均為無(wú)色。分別編號(hào)為北安Ⅰ、北安Ⅱ、北安Ⅲ、北安Ⅳ、海倫Ⅰ、海倫Ⅱ、海倫Ⅲ、海倫Ⅳ。

對(duì)不同菌株的菌落半徑（d）、透明圈半徑（D）進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算透明圈半徑與菌落半徑的比值（表1）。由表1可知，北安Ⅲ號(hào)的D/d值最高，北安Ⅰ號(hào)的D/d值其次，海倫Ⅳ號(hào)的D/d值最低。根據(jù)篩選原理[5]，在該種篩選條件下，北安Ⅲ號(hào)的解磷能力可能最高，而海倫Ⅳ號(hào)的解磷能力可能最低。

2.2 NBRIP培養(yǎng)基搖瓶復(fù)篩

在NBRIP培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)過(guò)程中，不同菌株生長(zhǎng)及解磷速度差異較大。經(jīng)2 d培養(yǎng)，多數(shù)菌株培養(yǎng)液整體渾濁，但也有少數(shù)菌株培養(yǎng)液較清澈，蜂窩狀的磷顆粒處于培養(yǎng)基底部，但經(jīng)再培養(yǎng)1 d后，所有菌株培養(yǎng)液皆整體渾濁。

解磷細(xì)菌具有解磷效應(yīng)，將其接種到NBRIP培養(yǎng)基，解磷細(xì)菌會(huì)將培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)磷分解為可溶性磷。如果接種入NBRIP培養(yǎng)基的菌種能在這種條件下具備解磷能力，則在培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基中可溶性磷的含量會(huì)上升。可溶性磷的含量上升的越多，其相應(yīng)的菌種的解磷能力則越強(qiáng)。基于鉬藍(lán)比色法，獲得了可溶性磷含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（圖1）。將初篩得到8個(gè)菌株接種入NBRIP培養(yǎng)基，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，基于可溶性磷含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)吸光度換算出可溶性磷含量，不同菌株接種前后的可溶性磷含量見(jiàn)表2。根據(jù)培養(yǎng)液上清液中可溶性磷含量的增加量的大小，從8個(gè)菌株中篩選出5個(gè)培養(yǎng)液中可溶性磷含量較高的菌株。分別是北安Ⅰ號(hào)、北安Ⅲ號(hào)、海倫Ⅱ號(hào)、海倫Ⅲ號(hào)、海倫Ⅳ號(hào)。其中海倫Ⅳ號(hào)的解磷能力最強(qiáng)，在100 mL的NBRIP培養(yǎng)基中，可溶性磷含量增加了431.045～735.397 mg/L，平行樣1大約是原來(lái)的可溶性磷含量的11倍。海倫Ⅱ號(hào)、海倫Ⅲ號(hào)、北安Ⅰ號(hào)、北安Ⅲ號(hào)的解磷能力也較強(qiáng)，可溶性磷含量最高增加超過(guò)200 mg/L。

3 小結(jié)與討論

傳統(tǒng)PVK平板篩選解磷微生物法是根據(jù)篩選平板上生長(zhǎng)的菌落周?chē)欠癞a(chǎn)生透明圈以及透明圈的大小來(lái)判斷菌株是否具有解磷能力，以解磷能力大小來(lái)進(jìn)行解磷微生物的分離和篩選[6]。由于該方法是建立在解磷菌株產(chǎn)酸的前提條件下，因此只有通過(guò)產(chǎn)酸機(jī)制了解解磷微生物，并且必須是能產(chǎn)生大量有機(jī)酸的解磷微生物才有可能被篩選出來(lái)[7]。由于不同微生物間產(chǎn)酸營(yíng)養(yǎng)條件存在差異，所以采用此方法篩選到的可能是只適合在該條件下產(chǎn)酸的微生物，透明圈的大小也僅反映出篩選菌株產(chǎn)有機(jī)酸的能力，不能真實(shí)地反映菌株實(shí)際的解磷能力，也由此反映出如果僅采用PVK平板篩選法來(lái)研究土壤環(huán)境中的解磷微生物群落或確定某一解磷微生物菌株解磷能力的大小會(huì)存在很大的片面性。本研究中經(jīng)初篩獲得的菌株較少，可能與此有關(guān)。

在篩選過(guò)程中，總體上初篩和復(fù)篩的相關(guān)性較強(qiáng)，即菌株在初篩中的溶磷圈較大，其在復(fù)篩中的溶磷效果也較強(qiáng)。但海倫Ⅳ號(hào)菌株在初篩過(guò)程中的溶磷圈最小，而在復(fù)篩中的溶磷效果很好，可能是由于該菌株在不同的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)代謝條件不同，即對(duì)培養(yǎng)條件和解磷對(duì)象有一定的專(zhuān)一性，以至于其解磷能力因培養(yǎng)環(huán)境的不同而不同。

在復(fù)篩過(guò)程中，菌株在NBRIP培養(yǎng)基中培養(yǎng)了3 d，之后進(jìn)行測(cè)量可溶性磷量，但菌液中的可溶性磷含量可能并非皆在第二天達(dá)到頂峰。因而，對(duì)培養(yǎng)液內(nèi)的磷含量進(jìn)行7 d的監(jiān)測(cè)并制備監(jiān)測(cè)曲線(xiàn)，可對(duì)溶磷動(dòng)態(tài)變化有更好的了解。總體上來(lái)看，經(jīng)PVK平板初篩、NBRIP搖瓶復(fù)篩，該技術(shù)體系獲得了可有效溶磷的細(xì)菌菌株，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)細(xì)菌磷肥打下了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李曉婷.磷細(xì)菌K3的GFP標(biāo)記與在土壤中定殖及對(duì)玉米生長(zhǎng)效應(yīng)研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[2] 馮月紅.苜蓿和小麥根際高效解磷細(xì)菌篩選及其溶磷效果的初步研究[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

[3] LIU H， WU X， REN J， et al. Isolation and identification of phosphobacteria in poplar rhizosphere from different regions of China[J]. Pedosphere，2011，21（1）：90-97.

[4] 馬 文.鉬藍(lán)法測(cè)定玉米漿中磷含量[J]. 安徽大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1996（1）：123-126.

[5] 王英健.解磷細(xì)菌的分離純化鑒定與生物學(xué)特性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（32）：13932-13933.

[6] PIKOVSKAYA R I. Mobilization of phosphates in soil in connection with the vital activities of some microbial species[J]. Mikrobiologiya， USSR，1948，17：362-370.

[7] 李文紅，施積炎.西湖沉積物中解磷菌的分離純化及其解磷能力[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2006，17（11）：2112-2116.