金溶膠基底的SERS增強效果的實驗研究

張心敏，史曉鳳，韓曉紅，馬海寬，馬 君

(中國海洋大學光學光電子實驗室， 山東 青島 266100)

0 引言

表面增強拉曼光譜(Surface-enhanced Raman Spectroscopy, SERS)技術作為一種極具發展潛力的光譜分析技術，逐漸成為表面科學和電化學領域有力的研究手段。因其靈敏度高、信息含量豐富、無需樣品預處理，且增強基底對生物體沒有損害等優勢，使其在探測分析生物醫學領域扮演越來越重要的角色。而高靈敏度SERS活性基底的制備是獲得SERS信號的前提。金溶膠以其使用方便、易于制備、性能穩定、靈敏度高的特點，已經成為SERS技術中最常用的增強基底之一[1]。

為了將SERS技術發展成一種常規、原位的痕量分析工具，提高活性基底的增強效果及其探測靈敏度尤為重要。在實際研究中，評價一個分析方法測試性能的重要指標主要是增強因子和檢測限。其中，增強因子(Enhancement Factor, EF)用來描述SERS基底的活性，可以表征基底對拉曼光譜的增強效果[2]；檢測限(Limit of Detection, LOD)則是評價一個分析方法、分析系統在低濃度范圍內的檢測水平的高低[3]。

結晶紫分子(Crystal Violet, CV)常被作為探針分子，用來研究SERS基底的活性。它是一種酸堿指示劑，能夠較好的吸附在金溶膠顆粒上，產生較強的表面增強拉曼散射效應[4]。Hidebrandt等[5]的研究表明CV的SERS光譜強度與其濃度或含量之間具有良好的線性關系；Liang等[6]通過向SERS體系中添加鹵素離子，實現了SERS增強因子的提高；首都師范大學的方炎小組[7]利用銀納米基底，研究了二十種氨基酸分子的結構，根據分子系列不同，通過調節pH值獲得較好的探測靈敏度；馬君小組[8]進一步研究發現，金溶膠體系在pH值為13的堿性環境下對多環芳烴的探測效果最佳。

本文利用CV分子作為探針分子，以金溶膠膜、自然狀態下(pH=6)以及通過改變體系的pH值達到最佳SERS增強效果時的金溶膠溶液(pH=13)為例，通過對比這三種活性基底的增強因子及其對CV溶液的檢測限，比較了金溶膠膜與金溶膠溶液增強效果的差異并分析了pH值對金溶膠溶液增強效果的影響。

1 實驗部分

1.1 試劑與材料

氯金酸、氫氧化鈉、檸檬酸鈉、鹽酸、濃硫酸、雙氧水、硝酸、結晶紫均購于國藥集團化學試劑有限公司；三氨丙基三甲氧基硅烷、2-吡咯烷酮購于阿拉丁試劑有限公司，所有試劑和藥品均為分析純，使用時未進一步提純。結晶紫溶液均使用去離子水配制為10-8～10-3mol/L的不同濃度。

1.2 儀器

電子天平( FA2104，上海精科天平)；超聲清洗器(KQ2200DB，昆山市超聲儀器公司)；磁力攪拌器(RCT basic，德國IKA公司)；移液器(QY-1000A，北京青云卓立精密設備有限公司)；恒溫干燥箱(DHG-9037A，上海精宏實驗設備廠)；紫外-可見分光光度計(UV-2550，日本島津公司)。

拉曼光譜探測系統如圖1所示，光譜儀為美國Ocean Optics公司的QE65000型拉曼光譜儀；光柵型號為H6，刻痕密度為1 200刻痕/mm，光譜分辨率為6 cm-1；光源采用的是785 nm近紅外連續半導體激光器，激光功率為80 mw；光纖探頭為美國InPhotonics公司的RIP-RPB-785型拉曼Y型光纖探頭。

圖1 拉曼探測系統結構示意圖Fig.1 Schematic diagram of experimental set-up

1.3 金溶膠及金溶膠膜的制備

采用化學還原法制備金溶膠[9]，將30 mL濃度為2 mmol/L的氯金酸溶液加熱至沸騰，緩慢加入10 mL一定濃度的檸檬酸鈉溶液，在沸騰狀態下攪拌回流60 min后冷卻至室溫。所得金膠為磚紅色，經測試其pH值為6。向金溶膠體系中添加適量氫氧化鈉，得到pH值為13的金溶膠溶液。

金溶膠膜的制備參考史曉鳳等改進的自組裝法[10]。配制體積比為5%的三氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)甲醇溶液，將清洗過的石英片放入沸騰的APTMS甲醇溶液中進行硅烷化3 h，使石英片表面附著氨基，有利于金屬納米顆粒的吸附。將石英片取出，清洗后交替浸入到已制備好的金溶膠中(1 h)和1 mmol/L的吡咯烷酮溶液中(0.5 h)，將上述浸泡過程重復5次，即可獲得對785 nm激發波長增強效果最佳的金溶膠膜[11]。

2 結果與討論

光譜數據采用origin8.1軟件對SERS光譜進行去基線處理。光譜探測時，每個樣品分別探測五次進行平均，積分時間統一設為10 s。

2.1 金溶膠及金溶膠膜的表征

SERS活性基底的制備對于獲得SERS信號至關重要。采用化學還原法獲得的金溶膠，在正常情況下經測試pH值為6，顏色為磚紅色，這是由于制備溶膠時檸檬酸鈉在加熱條件下生成的甲酸和乙酰乙酸未與氯金酸充分反應造成的[12]。實驗中發現，直接利用此自然狀態下的金溶膠溶液作為活性基底的增強效果一般。通過加入氫氧化鈉調節金溶膠體系的pH值可以改變金溶膠溶液中金納米顆粒的聚集程度，從而得到增強效果更佳的SERS活性基底[8]。隨著OH-離子在金溶膠溶液中濃度的升高，其顏色由磚紅色逐漸變為藍黑色。圖2(A)為 pH=6 和 pH=13 時的金溶膠溶液的消光光譜。分析此圖可知，在pH=6時，金溶膠溶液只有530 nm左右的一個等離子共振吸收峰，而當pH=13時，消光光譜除530 nm的峰外又明顯出現了一個760 nm左右的等離子共振吸收峰。這可能是由于金納米顆粒發生聚集而產生的。圖2所示(B)和(C)為平均粒徑為57 nm的金溶膠溶液在pH=6和pH=13時的掃描電鏡圖，可以看出金溶膠溶液在pH值為6的狀態下金納米顆粒只有少數聚合；而當pH值為13時，金納米顆粒出現顯著的聚合現象。

圖2 不同pH值金溶膠溶液的消光光譜(A)和SEM圖像(B:pH=6; C:pH=13)Fig.2 Extinction spectra (A) and SEM images (B and C) obtained from the gold colloid solutions with different pH values of pH=6 and pH=13

采用自組裝法制備金溶膠膜，通過控制APTMS甲醇溶液的溫度，控制吸附到石英片上APTMS的量，從而控制自組裝到石英片表面上金納米顆粒的個數，進而控制金溶膠膜等離子共振吸收峰的位置。得到靈敏度高、重復性好的SERS活性基底。圖3所示為金溶膠膜的消光光譜和SEM圖。相對于金溶膠的單分散性，納米顆粒在石英片上的自組裝以及顆粒之間的相互作用大大促進了金納米顆粒的聚集程度。從圖中可以看出，該金溶膠膜的平均粒徑為62 nm，除了具有金溶膠530 nm處的等離子共振吸收峰外，在與激發波長(即785 nm)相近處也出現了明顯的吸收峰。

圖3 金溶膠膜的消光光譜(A)和金溶膠膜的SEM圖像(B)Fig.3 Extinction spectra(A) and SEM image (B) obtained from the gold colloid film

2.2 結晶紫SERS光譜探測及增強因子的計算

圖4為5×10-7mol/L CV溶液分別以金溶膠膜、pH=6及pH=13的金溶膠溶液為活性基底的SERS光譜與10-3mol/L CV溶液的普通拉曼光譜的比較。圖中，CV溶液的拉曼光譜、以金溶膠膜和pH值為6的CV溶液為活性基底的SERS光譜分別放大了10倍、5倍和2倍。圖中標示出的CV的部分特征峰分別為：419 cm-1處的C-苯彎曲振動，722 cm-1、801 cm-1、1 172 cm-1的C-H彎曲振動，907 cm-1、941 cm-1處的環骨架振動，1 297 cm-1的苯環內C-C伸縮振動以及1 579 cm-1處的苯環內C-C伸縮、彎曲振動[13]。與CV溶液的普通拉曼光譜相比，以金溶膠為活性基底時，CV溶液的拉曼峰位有1～8 cm-1的頻移，說明CV分子與金納米顆粒之間發生了強烈的相互作用，并且CV分子中的N具有孤對電子、苯環上具有π電子，這些都使得CV分子很容易與金納米表面發生電荷轉移[14]。

圖4 三種不同基底的CV溶液(5×10-7 mol/L)SERS光譜(b, c, d)及較高濃度(10-3 mol/L)的CV溶液的拉曼光譜(a)比較. 所采用的基底分別為金溶膠膜(b)、pH=6金溶膠溶液(c)及pH=13金溶膠溶液(d)Fig.4 The SERS spectra of CV solution (5×10-7 mol/L) obtained with three different substrates of gold colloid film(b), gold colloid solution at pH=6 (c) and gold colloid solution at pH=13 (d). Spectrum (a) taken from CV solution ( 10-3 mol/L ) with conventional Raman setup as a comparison

以CV為探針分子，SERS活性基底的增強因子(EF)可通過下式計算[2]：

(1)

式中ISERS為CV分子的SERS信號強度，IRS為普通拉曼的信號強度，Nsurf和Nvol分別為SERS體系下和普通拉曼體系下有效散射體積內CV的平均分子數。

當以面積為S=0.6 cm×0.8 cm的金溶膠膜為SERS活性基底時，增強因子計算公式可進一步表示為:

(2)

式中Cvol=10-3mol/L和Csurf=5×10-7mol/L分別是普通拉曼探測和SERS探測時CV溶液的濃度，h=0.23 cm為有效散射深度，Vsurf=50 μL是滴加在金溶膠膜上的的CV溶液的體積。根據文獻，CV分子在粗糙表面的吸附率大約為10%[15,16]。

對于金溶膠溶液活性基底，SERS探測和拉曼探測時的有效散射體積近似相同，此時SERS增強因子的計算公式可以表示為：

(3)

以金溶膠膜以及pH=6和pH=13的金溶膠溶液為活性基底，選取CV位于722cm-1、801 cm-1、1172 cm-1處三個特征峰為例計算了其增強因子，結果如表1所示。

從表1可以看出，與金溶膠膜相比，金溶膠溶液作為基底時的增強因子更高。這是因為金溶膠體系是處于三維空間內，而金溶膠膜體系只是處于二維平面內，導致CV分子在相同有效散射面積內，在金溶膠溶液表面的吸附數量要遠大于金溶膠膜表面。所以金溶膠溶液的增強效果要優于金溶膠膜。對比兩種不同pH環境下金溶膠溶液的增強因子可知，pH=13時金溶膠溶液的增強效果有極大的提高，在1 172 cm-1處，其增強因子達到2.3×107。這可能是由于OH-的加入促進了金納米顆粒的聚合，導致pH=13的金溶膠溶液相對于pH=6的金溶膠溶液出現了一個與激發波長相近的等離子共振吸收峰(如圖2A)，使拉曼躍遷的幾率大大增加，同時聚合的金納米顆粒增強了粒子間的耦合從而增加了局域電磁場的強度，并且OH-的加入能夠增加金屬表面的活位數量從而增加與表面吸附的CV分子數量，使得SERS信號能夠進一步增強[6, 17]。

2.3 結晶紫檢測限的計算

為進一步比較金溶膠膜、pH=6及pH=13的金溶膠溶液的探測靈敏度，本文計算了以這三種金溶膠為活性基底時CV溶液的檢測限。圖5及圖6分別是以金溶膠膜為活性基底時不同濃度CV的SERS光譜以及CV溶液722 cm-1、801 cm-1、1 172 cm-1處特征峰的拉曼峰強與濃度之間的關系。以pH=6以及pH=13的金溶膠溶液為SERS基底時CV溶液位于722 cm-1、801 cm-1、1 172 cm-1處的拉曼峰強與濃度之間的關系如圖7及圖8所示，圖中的誤差條均為標準偏差。從中可以看出，以金溶膠膜為活性基底時，對同一樣品多次探測的標準偏差明顯大于以金溶膠溶液為基底時。這表明，采用金溶膠溶液為活性基底更有利于樣品的定量分析。

根據檢測限的計算公式：

(4)

式中σ為多次測得空白響應信號的標準偏差，k為CV定標曲線的斜率。經上述公式計算，結果如表2所示。

由表2可知，CV溶液在金溶膠膜、pH=6及pH=13的金溶膠SERS基底上的檢測限分別能夠達到70.7 nmol/L、9.6 nmol/L和1.8 nmol/L。充分表明，調節金溶膠溶液的pH值，可以有效的提高基底的SERS增強效果，降低其對CV溶液的檢測限。

圖5 不同濃度CV溶液在金溶膠膜上的SERS光譜. (a) 500 nmol/L, (b) 700 nmol/L, (c) 800 nmol/L, (d) 900 nmol/L, (e) 1 000 nmol/LFig.5 The SERS spectra obtained from CV solution of different concentrations of 500 nmol/L(a), 700 nmol/L (b), 800 nmol/L (c), 900 nmol/L(d) and 1 000 nmol/L (e) with the substrate of gold colloid film

圖6 金溶膠膜為SERS基底時CV在722 cm-1、801 cm-1和1 172cm-1拉曼頻移處的定標曲線Fig.6 Calibration curve for CV at Raman shifts of 722 cm-1, 801 cm-1 and 1 172cm-1 with the substrate of gold colloid film

圖7 pH=6的金溶膠溶液為SERS基底時CV在722 cm-1、801 cm-1和1 172 cm-1拉曼頻移處的定標曲線Fig.7 Calibration curve for CV at Raman shifts of 722 cm-1，801 cm-1 and 1 172 cm-1 with the substrate of gold colloid solution(pH=6)

圖8 pH=13的金溶膠溶液為SERS基底時CV在722 cm-1、801 cm-1和1 172 cm-1拉曼頻移處的定標曲線Fig.8 Calibration curve for CV at Raman shifts of 722 cm-1，801 cm-1 and 1 172 cm-1 with the substrate of gold colloid solution(pH=13)

由表2可知，CV溶液在金溶膠膜、pH=6及pH=13的金溶膠SERS基底上的檢測限分別能夠達到70.7 nmol/L、9.6 nmol/L和1.8 nmol/L。充分表明，調節金溶膠溶液的pH值，可以有效的提高基底的SERS增強效果，降低其對CV溶液的檢測限。

3 結論

通過計算CV溶液在金溶膠膜、pH=6和pH=13的金溶膠溶液表面的SERS增強因子以及在這三種金溶膠基底上CV溶液的檢測限，分析了這三種SERS基底的增強效果。計算結果表明，在785 nm近紅外激發條件下，這三種活性基底都能得到較好的SERS增強，尤其是pH=13時的金溶膠溶液，能達到高于金溶膠膜及pH=6的金溶膠溶液103和102倍的增強。利用這三種金溶膠基底對CV進行SERS探測，可以得到CV的檢測限分別為70.7 nmol/L、9.6 nmol/L 和1.8 nmol/L。說明，金溶膠溶液的增強效果要明顯優于金溶膠膜，而調節金溶膠體系的pH值能夠達到使其探測靈敏度進一步提高的目的。因此，調節pH的金溶膠體系是一種在生物醫學乃至臨床醫學研究中具有廣闊應用前景的SERS活性基底。

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