CIK細胞對肺腺癌細胞殺傷作用的實驗研究

趙 鑫,劉玉俠,常 穎,王啟文*,盧衛平, 王 寶,于 鴻

(1.吉林省腫瘤醫院，吉林 長春130012；2.吉林省腫瘤防治研究所，吉林 長春130012)

本實驗以肺腺癌細胞株SPC-A-1作為靶細胞，通過體外實驗觀察細胞因子活化的殺傷細胞(cytokine induced killer cell，CIK)對其的殺傷效果，為CIK臨床應用治療肺腺癌提供實驗數據。

1 材料和方法

1.1試劑細胞培養液IMDM，購于上海立菲生物技術有限公司；細胞因子IFN-γ，上海凱茂生物醫藥有限公司；IL-1α，peprotech公司；anti-hunman CD3，Biolegend公司；IL-2，北京四環生物制藥有限公司;FCS，北京元亨;MTT購自Sigma ;anti-hunman CD3-FITC,anti-hunman CD16、CD56-PE,購自 BD公司。

1.2肺腺癌細胞株SPC-A-1 吉林省腫瘤防治研究所提供。

1.3實驗設備低溫高速離心機，SORVALL公司；HERA CEEL 240iCO2培養箱，Thermo Scientific公司；全自動酶標儀，芬蘭雷勃公司；流式細胞儀，BD公司。

1.4方法

1.4.1 人外周血單核細胞的獲取 用吉林省腫瘤防治研究所提供的紅細胞裂解液[1]分離，提取人外周血單核細胞后，用含10%FCS的IMDM培養液調細胞數為1×106/ml，加到細胞培養瓶，放入37℃，5%CO2培養箱培養。

1.4.2 CIK細胞的誘導 將以上提取的外周血單核細胞培養1天后，觀察無細菌污染后，加入IFN-r，再培養1天后，加入anti-humanCD3、IL-1α、IL-2 等細胞因子，培養 3天后分瓶，同時補加IL-2。

1.4.3 CIK細胞的鑒定 將培養第10天的CIK細胞用0.9%生理鹽水洗滌，計數(1×106/ml)，分別用FITC標記的CD3Ab、PE標記的CD16、CD56Ab對CIK細胞進行標記，冰上孵育30 min，用流式細胞儀檢測CIK細胞中CD3+CD16+CD56+細胞的表達

1.4.4 肺腺癌細胞株SPC-A-1的培養 將在液氮中凍存的SPC-A-1復蘇后用含10%IMDM的培養基培養至生長旺盛期，用0.25%胰酶消化，用IMDM培養液洗滌后，調整細胞數為5×104/ml，接種到96孔細胞培養板,100 μl/孔。

1.4.5 CIK細胞對SPC-A-1殺傷活性 將培養的CIK細胞分為兩組計數，第1組細胞數為2.5×106/ml，第2組細胞數為1.25×106/ml，按以下步驟加入到已接種SPC-A-1的96孔細胞培養板內，100 μl/孔，每組設6復孔。第1組：SPC-A-1對照；第2組：CIK1對照(2.5×106/ml)；第3組：CIK2對照(1.25+106/ml)；第4組；CIK1+SPC-A-1(50∶1)；第5組 CIK2+SPC-A1(25∶1)。培養48 h。培養結束前4 h加入MTT，用酶標儀在292 nm處測OD值。

1.4.6 殺傷活性測定方法 殺傷活性=[(1- 實驗組OD值-效應細胞OD值)/靶細胞OD值]×100%。

1.5統計學處理采用t檢驗對數據進行處理。

2 結果

2.1CIK細胞鑒定結果如圖1。從圖中標定的結果可以看出，CD3+CD16+CD56+的標記率較高，達到了74.3%，說明培養的細胞CIK數量較多。

圖1 CIK細胞鑒定結果

2.2CIK細胞對SPC-A-1細胞殺傷活性，見表1。

3 討論

目前，生物治療已經成為惡性腫瘤繼手術、化療、放療后的第四大治療方式。由于生物治療對身體無傷害，可以提高機體的免疫功能，對微小轉移病灶具有一定的清除作用，同時能改善病人的生活質量，所以在腫瘤治療領域具有廣闊的應用前景[2-4]。

表1 CIK細胞對SPC-A-1細胞殺傷活性

※P<0.05 與1∶25CIK2相比

本實驗選取生物治療細胞中的一種細胞-CIK細胞作為研究對象，觀察其對肺腺癌細胞SPC-A-1的體外殺傷作用，為臨床應用提供理論參考。

CIK細胞(cytokine-induced killer)因其具有NK細胞的非特異性殺傷作用，對腫瘤細胞的殺傷性無MHC限制的特點[5]，以及強大的T淋巴細胞的抗瘤活性[6]，也被稱為NK細胞樣T淋巴細胞，在腫瘤細胞免疫方面發揮著重要作用[7,8]。

本實驗通過體外不同細胞因子組合，誘導出了具有高表達CD3+CD16+CD56+的CIK細胞，并且通過體外實驗，驗證CIK細胞對肺腺癌細胞株SPC-A-1殺傷活性。實驗結果證明，在CIK與SPC-A-1比率為50∶1時殺傷率可達70%，說明CIK對腫瘤細胞的強大殺傷力。而且通過不同數量的CIK與SPC-A-1比率殺傷活性的比較證明，殺傷活性隨著CIK細胞數量的增加，具有對腫瘤細胞更強的殺傷能力(50∶1>25∶1，P<0.05)。此實驗結果也提示我們，在臨床應用時一定要達到細胞數量，才能保證甚至提高治療效果。

參考文獻：

[1]劉玉俠，夏鳳琴，石虹，等.LiCL對臍血有核細胞增殖、凋亡及細胞周期的影響[J].實用腫瘤學雜志，1998,12(1)：15.

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[3]Rosenberg S.Lymphokine-activated killer cells:A new approach to immunotherapy of cacer [J].J Natl Cacer Inst,1985,75(4):595.

[4]Rosenberg SA，Spiess P,Lafreniere R.A new Approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor-infiltrating lymphocytes[J].science,1986,233(4770):1318.

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[6]Shablak A,Hawkins RE,Rothwell DG,et al.T cell-based immunotherapy of metastatic renal cell carcinoma:Modest success and future perspective[J].Clin Cancer Res,2009,15(21):6503.

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[8]Sehmidt-Wolf IG,Lefterova P,Nehta BA,et al.Phenptypic characterization and identification of effector cells involved in tumor cell regognition of cytokine-induced killer cells[J].Exp Hematol,1993,21(13):1673.