抗菌性室溫固化PMMA材料的細胞毒性及致突變性研究

申證暄,張賜童,孫世群,王玉峰,王曉容*

(1．吉林大學口腔醫學院，吉林 長春130021；2．吉林大學口腔醫院 修復科，吉林 長春130021)

室溫固化聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate，PMMA)是口腔修復臨床應用的主要材料之一，具有操作簡單、固化迅速、價格便宜等優點。但由于其特殊組成、表面多孔性和吸水性，易造成微生物的定殖難以清除，從而破壞口腔內微生態平衡，引起口腔疾病。納米載銀無機抗菌劑兼具納米無機材料超微性、比表面積大特征和銀離子的抗菌廣譜、強效等優勢而受到了學者的廣泛認可[1]。本課題組已有研究表明[2]：添加2%納米載銀無機抗菌劑的室溫固化PMMA材料可以有效改善原材料的抗菌性，且不會對材料的機械性能產生不良影響。本實驗通過細胞毒性試驗和微核試驗，檢測含2%納米載銀抗菌劑的室溫固化PMMA材料的細胞毒性及潛在致突變性，為評價其生物安全性提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1主要材料及儀器日進義齒基托聚合物Ⅱ型粉劑(仿生型)液體(日進齒科材料有限公司)；納米載銀無機抗菌劑RHA-1(上海潤河納米材料科技有限公司)；小鼠成纖維細胞(中科院上海細胞庫)；酶聯免疫檢測儀(美國Thermo公司)；昆明小鼠(吉林大學實驗動物中心)；吉姆薩染液(南京建成科技有限公司)；環磷酰胺(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司)；小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)。

1.2樣品制備按比例將納米載銀無機抗菌劑與室溫固化PMMA粉劑混合，置球磨機中研磨8 h制成抗菌母料，母料中再次加入一定室溫固化PMMA粉劑，研磨24 h稀釋成含2%濃度抗菌劑的室溫固化PMMA。按規定粉液比，在室溫20℃左右條件下，制成試件。將試件按1 g∶5 ml的比例， 37℃恒溫箱中浸提24 h，制備浸提液。

1.3細胞毒性實驗方法選取L929細胞，培養至細胞貼壁生長，收集細胞并計數，將細胞接種至96孔板，每組6孔，每孔細胞數為4×103個，培養24 h，棄原液，PBS漂洗2次，實驗組加入100 μl 100%浸提液，空白組加入100 μl新鮮培養液，陽性對照組加入100 μl DMSO，培養48 h。向培養板中加入濃度為0.2 mg/ml的MTT繼續孵育4 h，棄上清，加入200 μl DMS，在酶標儀上測定其在490 nm處OD值，并計算細胞相對增值率。

1.4微核實驗方法健康昆明小鼠50只，雌雄各半，隨機分5組，每組10只(實驗過程中各別昆明小鼠死亡，補足每組10只)。各實驗組均以50 ml/kg浸提液灌胃毒染，其中高劑量組濃度為200 mg/ml，中劑量組濃度為40 mg/ml，低劑量組濃度為8 mg/ml，陰性對照組以50 ml/kg生理鹽水灌胃毒染，陽性對照組以40 mg/kg環磷酰胺腹腔注射毒染。采用30 h給受試物法，末次毒染6 h后頸椎脫臼處死。取股骨骨髓制片，每只小鼠涂片1張。在空氣中自然晾干后放入甲醇中固定10-15 min。用1份Giemsa 儲備液：6份pH6.8磷酸鹽緩沖液配成Giemsa 應用液，染色15-20 min，蒸餾水沖洗并晾干。先以低倍鏡粗檢，選擇細胞分布均勻，染色良好的區域，再在1000倍鏡下觀察計數。嗜多染紅細胞呈灰藍色，成熟紅細胞呈橘紅色，微核為紫紅色或藍紫色。每片計數1000個嗜多染紅細胞，計算微核率。同時考慮200個細胞中嗜多染紅細胞與成熟紅細胞比值，若比值≥1為正常，若比值<1可能對骨髓細胞產生毒性。

1.5統計學分析

實驗數據采用卡方檢驗，P<0.05時具有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗組毒性反應均為0級，陽性對照組細胞毒性為4級，見表1。

2.2 實驗組與陰性對照組比較，小鼠PCE微核率無顯著差異(P>0.05)，但各實驗組的微核率均低于陽性對照組(P<0.05)，見表2。骨髓細胞涂片中可見微核細胞、單核細胞及雙核細胞。

表1 抗菌性與非抗菌性室溫固化PMMA組OD值比較(平均值±標準差)

表2 各實驗組微核率比較(平均值±標準誤)

△:與陽性對照組比較，P<0.05

3 討論

生物材料應具有良好的組織相容性[3，4]、生物安全性及功能性。遺傳毒性試驗是生物安全性重要檢測指標之一，用于評價材料的致畸、致癌、致突變能力，以了解材料對機體的遠期作用。微核試驗是通過觀察細胞中微核的形成來檢測遺傳毒物，其結果陽性說明受試物是遺傳毒物，具有潛在致突變作用。

根據國家標準YY/T0127.12-2008，實驗陰性組微核細胞率應小于0.5%，本實驗陰性對照結果為0.28%，符合要求。環磷酰胺是國家標準中規定的具有致突變作用的陽性指示劑之一，應用劑量為40 mg/kg時微核率范圍一般為2.2%-3.0%[5]，本實驗陽性對照結果為2.63%，符合要求。實驗得出的結果表明本次試驗操作規范及動物的靈敏度正常。并且，實驗陰性對照組與陽性對照組的微核率差異有統計學意義，證明此實驗結果可信。

細胞毒性試驗是醫療生物學評價體系中重要的檢測指標之一，幾乎是各種用途的醫療器械和材料臨床應用前的必選項目。噻唑藍比色法被稱之為“細胞毒性檢測的標準方法”[6]，具有較高靈敏度，檢測指標客觀[7]且能定量分析。因此本實驗采用該方法進行體外細胞毒性檢測。細胞毒性結果顯示，在本試驗條件下，L-929 細胞在經過受試物浸提液培養2 d后，經MTT 法檢測所得細胞毒性為0 級，受試物對該細胞無毒性作用。倒置顯微鏡下出現同樣結果，各組圖片中細胞均未見細胞的細胞膜破壞，細胞核異常。可以認為含2%濃度納米載銀抗菌劑的室溫固化PMMA材料無細胞毒性。

參考文獻：

[1]趙明哲，汲 平.納米技術在口腔修復領域的應用前景及進展[J].口腔頜面修復學雜志，2008，9(01)：76.

[2]賈春麗，王曉容，張賜童，等.添加納米載銀無機抗菌劑的室溫固化PMMA材料體外抗菌效果評價[J].吉林大學學報(醫學版)，2012，38(02)：899.

[3]Sadowsky SJ. An overview of treatment considerations for esthetic restorations:A review of the literature[J].Prosthet Dent，2006，96(6)：433.

[4]Hao W，Hu YY，Wei YY，et al.Collagen I gel can facilitate homogenous bone formation of adipose-derived stem cells in PLGA-beta-TCP scaffold[J].Cells Tissues Organs，2008，187(2)：89.

[5]陸 華，孫 皎，黃哲偉，等.微核試驗評價強化聚乙烯的潛在致突變性[J].口腔材料器械雜志，1999，8(02)：68.

[6]Rossberg S. Standardverfahren for die Zytotoxizitatsprufung:der MTT-Test[J].Z Zahnarrztl Implantol,1988,4:251.

[7]Mockers O,Deroze D,Camps J.Cytotoxicity of orthodont ic band s,brackets and archw ires in vitro[J].Dent Mater,2002,18(4):3.