HBoV VP1-U蛋白抗原的表達純化

漆正宇，龔英浩

(1. 北京大學深圳醫院 中心實驗室，廣東 深圳518036；2.病毒基因工程國家重點實驗室，北京100052；3.貴州大學 生命科學院，貴州 貴陽550025)

人博卡病毒(Human Bocavirus,HBoV)為2005年首次報道的一種感染人呼吸道的細小病毒[1]，是人支氣管炎的一種病原體[2,3]。細小病毒外觀呈球形無包膜的正20面體，直徑大約20-25 nm[4]。HBoV基因組為單鏈DNA，全長大約5.6 kb，主要編碼的蛋白有NS1、NP-1、VP1、VP2等[1]。其衣殼蛋白包括VP1和VP2，VP1基因包含5’端的獨有區(unique region of VP1，VP1-U)序列和3’端的VP2序列，是一個典型的重疊基因[1]。一般而言，細小病毒VP2是占病毒衣殼95%的主要蛋白，而VP1蛋白N端的VP1-U在病毒感染入胞中有重要意義[5]。本研究表達純化有活性的HBoV VP1-U蛋白抗原，為臨床免疫診斷方法的建立及蛋白功能研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 PMSF溶液 PMSF粉末0.174 g溶解于10 ml異丙醇，1.5 mlEP管分裝，-4℃保存。

1.1.2 蛋白純化溶液體系 10×buffer 1：Tris堿粉末1.21 g溶解于50 ml H2O中，然后加入NaCl 14.61 g，加H2O到95 ml體積，滴加0.1 M HCl調節pH=7.9，補充H2O至總體積為100 ml。5×buffer 2：Tris 0.61 g溶于50 ml H2O，再加入NaCl 14.61 g和C3H4N213.62 g，加H2O至95 ml，0.1 M HCl調節pH=7.9，補加H2O到總體積為100 ml。buffer A： buffer 1中加入至CH5N3·HCl，CH5N3·HCl終濃度為6 M。7.5 M的CH5N3·HCl。0.1 M的NiSO4。

1.1.3 菌株和培養基 大腸桿菌BL21(DE3)株為本室保存。細菌增菌培養基為LB液體培養基。LB分選固體平板為LB液體培養基含1.5%瓊脂糖，高壓滅菌后，添加相應篩選抗生素鋪板，室溫冷卻成固體平板培養基。

1.1.4 各種工具酶和試劑 各種限制性內切酶和Ex-Taq PCR反應體系(Takara)； T4 DNA Ligase連接酶體系(NEB)；凝膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒(Geneaid)； DNA提取試劑盒(Qiagen)； pGEM○R-T Easy載體TA克隆試劑盒(Promega)； BCATMProtein Assay Kit蛋白純化試劑盒(PIERCE)。引物由上海生工公司合成。親和層析柱HiTrapTM 1 ml Chelating HP(Amersham)。

1.2 方法

1.2.1 VP1-U蛋白抗原性分析 用DNAStar Protean軟件分析VP1-U蛋白抗原性，初步了解VP1-U段在VP1中的抗原性強弱。

1.2.2 HBoV VP1-U密碼子改造 HBoV VP1-U DNA序列在大腸桿菌中表達的會有一些大腸桿菌不偏愛的稀有密碼子，在http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC/上在線分析，得到稀有密碼子的分布情況。使用Vector NTI 9軟件針對大腸桿菌密碼子頻率初步改造VP1-U DNA，改造后氨基酸序列與原序列一致。

1.2.3 重組表達載體pET30a(+)/VP1-U的構建 采用pET30a(+)為載體在大腸桿菌中克隆表達重組蛋白。密碼子改造好的VP1-U在DNA 5’和3’端分別附帶NdeI(CA^TATG)和XhoI(C^TCGAG)限制酶序列，交上海生工公司合成。TA克隆序列后，構建到pET30a(+)載體上，測序鑒定。

1.2.4 VP1-U蛋白表達純化 制備上柱樣品：在含kalamycin的500 ml LB培養基中37℃搖菌至OD600 0.4-1；IPTG 1.5 mM誘導表達2 h(經IPTG梯度濃度和分時抽樣確定此最佳條件)；蛋白提取全過程程4℃低溫操作，每1 h加入終濃度為1 mM的蛋白酶抑制劑PMSF；離心收集菌液，約20 ml buffer 1洗滌一次；超聲破碎后高速離心30 min，棄上清，沉淀用5 ml buffer A重懸，室溫放置3 h以充分溶解包涵體；高速離心1 h，上清過0.22 μm濾器成上柱樣品。樣品上柱純化順序：依次5倍柱體積純水和buffer 1洗柱，2倍柱體積0.1 M NiSO4上柱(上鎳)；5倍柱體積buffer 1和buffer A洗柱；上樣，buffer A洗樣至無峰；20 ml buffer A分多次(5次以上)梯度攙兌buffer 1洗柱，直至洗柱液buffer A經梯度攙兌最終被替換為純buffer 1，且洗至無峰；buffer 2洗脫，收集峰值洗脫液即為目的蛋白液。超濾換液純化蛋白：加2 ml洗脫峰液入3 kD截流超濾管，7500×g離心6 h，期間每小時補充一次buffer 1至超濾管液體為2 ml。純品VP1-U蛋白進行SDS-PAGE不連續電泳，考馬斯亮藍染色后判斷純化結果，并BCA定量。

2 結果

2.1 VP1-U蛋白抗原性分析

DNAStar軟件分析結果顯示，VP1-U蛋白具有較強的抗原性、親水性和表面概率。

圖1 VP1-U蛋白抗原性分析

2.2 VP1-U DNA改造后的序列

我們檢測編碼CZ688的HBoV病毒株VP1-U DNA序列按照大腸桿菌密碼偏愛優化改造如圖2。

圖2 VP1-U密碼子優化改造后的序列

2.3 VP1-U表達純化

樣品穿過鎳柱的吸光度最高峰為105，收集吸光度75～105間急速上升和下降時的洗脫液，超濾換液。純化過程中各步驟樣品檢測SDS-PAGE不連續電泳圖(圖3)，純化蛋白大小符合VP1-U大小(15.5 kD)。純化后蛋白終濃度BCA定量為3.3 mg/ml。氨基酸末端測序證實蛋白序列正確。

M：蛋白標準(kD)；1：誘導前；2：誘導后；3：超聲破碎上清；4：上清洗脫液；5：包涵體溶解液洗脫峰；6：包涵體溶解液洗脫峰超濾。

3 討論

HBoV VP1-U原始序列并不適合原核表達，而密碼子優化后，獲得了理想的表達效果。為使蛋白的純化相對簡便和高效，首選pET30a(+)母載體自帶組氨酸標簽表達，鎳離子親和層析。HBoV VP1-U活性氨基酸集中在較靠近N端的位置，而其C端所連接的VP2的N端富含甘氨酸且多變，因此采用C端融合表達可能最大限度保證蛋白的抗原性。在pET30a(+)載體中選用NdeI(CA^TATG)和XhoI(C^TCGAG)為限制酶，可以使VP1-U 5’端處于SD序列的理想位置，且3’端融合表達除純化標簽6His外盡可能少。

菌體代謝優先消耗培養基中的葡萄糖，當葡萄糖不足時開始利用乳糖為能源。pET30a(+)/VP1-U超表達時，因葡萄糖已經消耗為不足而質粒通過T7啟動子啟動乳糖操縱子，乳糖操縱子控制目的基因VP1-U超表達，因此，在培養初期添加適量葡萄糖使得質粒不啟動目的基因表達而有利增菌，IPTG誘導時細菌數量足夠大即可在短期里獲得大量超表達目的蛋白。

許多真核蛋白基因在大腸桿菌中高效表達時，產物以一種無活性的、不溶于水的包涵體形式存在。包涵體除含有重組蛋白聚合物外，還含有核酸和其他雜蛋白。超聲裂解菌體和回收包涵體可以去除大部分雜質，但還需要復性和純化才能得到高純度的活性蛋白。HBoV VP1-U表達，雖然菌體裂解上清也存在目的蛋白帶，但從上清不能純化來看，似乎是超聲裂解時目的蛋白和其他雜蛋白斷裂所致，因此，VP1-U主要以包涵體的形式存在。我們采用，在鎳離子柱上更換緩沖體系，洗脫的同時得到復性蛋白，大大簡化了流程。

螯和親和層析的關鍵是上柱樣品的置備和緩沖體系的設計。純化過程中我們發現表達的產物非常容易被蛋白酶降解，包涵體溶解前需要低溫操作，并加入蛋白酶抑制劑。保持上柱樣品的溶劑體系與洗柱、洗脫體系一致，并且能保持一致，是流程設計中要考慮的關鍵問題。目的蛋白的功能研究涉及到磷脂酶活性，避免采用磷酸鹽緩沖體系。本研究采用自設計的高倍濃度的Tris緩沖體系儲存液，工作液隨用隨攙兌，最大限度保持了緩沖體系的一致，成功得到了活性[6]高濃度蛋白洗脫液。這種梯度攙兌法也是實現邊洗脫邊復性的基礎。

本研究通過包涵體的提取、變性、目的蛋白的純化和復性等一系列工作，得到了有生物學活性的純融合蛋白，為HBoV的免疫學檢測方法研究和蛋白功能研究提供了技術路線和材料。

參考文獻：

[1]Allander T,Tammi MT,Eriksson M,et al.Cloning of a human parvovirus by molecular screening of respiratory tract samples[J].Proc Natl Acad Sci USA,2005,102:12891.

[2]Simon A,Groneck P,Kupfer B,et al.Detection of bocavirus DNA in nasopharyngeal aspirates of a child with bronchiolitis[J].J Infect,2007,54(3):e125.

[3]Hirose Y,Hamada H,Wakui T,et al.Characteristic systemic cytokine responses in children with human bocavirus-positive lower respiratory tract infection[J].Microbiol Immunol,2014,58(3):215.

[4]Cotmore S F,Tattersall P.Characterization and molecular cloning of a human parvovirus genome[J].Science.1984,226:1161.

[5]Mavis AM,Michael GR.The Structure of Human Parvovirus B19[A].Anderson LJ,Young NS (eds).Human Parvovirus B19[M].Monogr Virol.1997,vol 20:3-15.

[6]Qu XW,Liu WP,Qi ZY,et al.Phospholipase A2-like activity of human bocavirus VP1 unique region[J].Biochem Biophys Res Commun,2008,365(1):158.