血管性認(rèn)知障礙大鼠學(xué)習(xí)記憶、血清EPCs、NO、VEGF變化及電針的干預(yù)作用

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(1.安徽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，合肥 230601；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，合肥 230061；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，合肥 230038)

·實(shí)驗(yàn)研究·

血管性認(rèn)知障礙大鼠學(xué)習(xí)記憶、血清EPCs、NO、VEGF變化及電針的干預(yù)作用

錢善軍1,陳幸生2*,周婷2,程紅亮2,張聞東2,李飛2,蔡榮林3,吳生兵3,陳國(guó)慶3,王儲(chǔ)蓄3,何俊良3

(1.安徽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，合肥 230601；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，合肥 230061；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，合肥 230038)

目的 觀察電針對(duì)血管性癡呆(VD)大鼠學(xué)習(xí)記憶、內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)數(shù)量、氧化亞氮(NO)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的影響。方法 四血管阻斷制作VD模型大鼠,水迷宮檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)數(shù)量、ELISA放射免疫法檢測(cè)VEGF含量、硝酸還原酶法檢測(cè)NO并與茴拉西坦對(duì)照。結(jié)果 與空白對(duì)照組比較，電針能夠改善血管性認(rèn)知障礙大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，提高外周血血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量，升高血清NO和VEGF水平。結(jié)論 電針可通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖、分化，上調(diào)血管生長(zhǎng)因子NO和VEGF表達(dá)，從而促進(jìn)腦微血管新生，恢復(fù)神經(jīng)功能，提高學(xué)習(xí)記憶能力。

血管性認(rèn)知障礙；針灸療法；內(nèi)皮祖細(xì)胞；血管新生；大鼠

血管性認(rèn)知障礙(VCI)是伴隨著腦血管病的發(fā)生出現(xiàn)的一種記憶、認(rèn)知和行為等障礙的綜合征，其中較為嚴(yán)重的又稱血管性癡呆(VD)。近年來(lái)，隨著我國(guó)老齡人口的不斷增多，血管性癡呆這一問(wèn)題日益突出。流行病學(xué)調(diào)查[1]表明:我國(guó)VD發(fā)病率占老年癡呆癥病例的比例逐年上升，已成為影響我國(guó)中老年人健康和生活質(zhì)量的常見(jiàn)病、多發(fā)病。血管性認(rèn)知障礙發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚無(wú)特別有效的治療方法,從治療“血管新生(Angiogenesis)”入手是治療缺血性疾病的常用手段之一。大量研究[2-5]提示：針灸對(duì)VD具有多環(huán)節(jié)、多層次、多途徑的調(diào)整作用，可以產(chǎn)生清除自由基、改善腦血液循環(huán)、調(diào)節(jié)記憶相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)、保護(hù)腦神經(jīng)元等作用。國(guó)內(nèi)對(duì)針灸影響腦內(nèi)血管新生的機(jī)制研究較少，筆者對(duì)血管性認(rèn)知障礙大鼠腦內(nèi)血管新生與電針干預(yù)機(jī)制進(jìn)行了研究。報(bào)道如下。

1 材料

1.1 動(dòng)物及分組 選擇清潔級(jí)成年雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。經(jīng)1周適應(yīng)性飼養(yǎng)后,進(jìn)行學(xué)習(xí)訓(xùn)練，篩除訓(xùn)練過(guò)程中反應(yīng)過(guò)于遲鈍或敏感的大鼠。隨機(jī)選取12只作為假手術(shù)組(假模型組)，其余大鼠制作血管性認(rèn)知障礙模型，模型制作后第4天用跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)合潛伏期成績(jī)測(cè)試再次篩選合格認(rèn)知障礙大鼠并保留36只,隨機(jī)分為3組，電針實(shí)驗(yàn)組(治療組)、空白對(duì)照組(模型對(duì)照組)和西藥治療組(茴拉西坦組),每組12只。

1.2 主要儀器與試劑 儀器:G6805-1型電針治療儀(青島華聲儀器廠)；SDQ-30雙極射頻電凝器(上海華誼儀器制造廠)；Morris水迷宮(北京新天地科技公司)；XD-711酶標(biāo)儀(上海迅達(dá)醫(yī)療器械公司)；FC-500流式細(xì)胞儀為Beckman Coulter公司產(chǎn)品。試劑：NO試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)20120519)；VEGF ELISA試劑盒(上海藍(lán)基生物科技有限公司，批號(hào)Z1ZFBZAA02)；細(xì)胞標(biāo)記物CFS-conjugated-anti-humanVEGFR2/KD由R&D公司提供；PE-conjugated-anti-human CDl33/ACl33由eBioscience公司提供；PC5-conjugated-anti-humanCD34由Beckman Couher公司提供。

2 方法

2.1 血管性癡呆模型復(fù)制 參考文獻(xiàn)[3]方法稍加改良制作VD動(dòng)物模型。方法：大鼠麻醉后俯臥固定于立體定向儀，暴露雙側(cè)第一頸椎橫突翼小孔,用直徑0.5 mm的電凝針燒灼雙側(cè)翼小孔內(nèi)的椎動(dòng)脈，造成永久性閉塞。第2天再將大鼠仰臥固定，小心分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，用微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈10 min，間隔1 h后再夾閉10 min，共夾閉3次。頸總動(dòng)脈夾閉2 min內(nèi)瞳孔不散大者棄之。傷口縫合前局部使用抗生素防止感染。假手術(shù)對(duì)照組手術(shù)過(guò)程同VD組大鼠但不熱凝椎動(dòng)脈、不夾閉頸總動(dòng)脈。

2.2 干預(yù)方法 1)電針實(shí)驗(yàn)組：大鼠固定于鼠板，用特制的大鼠頭部固定器固定大鼠頭部，在大鼠的清醒狀態(tài)下，選取百會(huì)、大椎、神庭、水溝穴剃毛點(diǎn)記，按照人體穴位的定位方法并參照大鼠骨骼與體形確定穴位。用φ0.3 mm×15 mm毫針沿皮刺進(jìn)針5 mm或斜刺，百會(huì)穴與大椎、神庭與水溝成對(duì)分別接G6805電針儀，疏密波，強(qiáng)度以大鼠能耐受為度，通電20 min。1次/d，10次為1療程，共治療3療程，療程之間休息2 d。2)西藥治療組:茴拉西坦0.062 5 g/kg體質(zhì)量，與蒸餾水混合成0.01 g/mL濃度的溶液，灌胃1次/d，療程與電針實(shí)驗(yàn)組平行。3)空白對(duì)照組：與電針實(shí)驗(yàn)組平行，只作鼠板上固定而不作其他任何處理。

2.3 檢測(cè)方法

2.3.1 行為學(xué)記憶成績(jī)測(cè)試 電針及西藥治療結(jié)束后開(kāi)始水迷宮檢測(cè)。水迷宮內(nèi)水深41 cm，水溫22～26 ℃。在水池壁標(biāo)明4個(gè)入水點(diǎn)將水池等分為4個(gè)象限，隨機(jī)選擇一個(gè)象限正中放置平臺(tái)，沒(méi)于水下1 cm，水面覆蓋塑料泡沫。1)定位航行試驗(yàn)歷時(shí)6 d，1次/d。將受試大鼠按順時(shí)針?lè)较蛞来斡?個(gè)入水點(diǎn)順序面向池壁放入水中，記錄2 min內(nèi)尋找平臺(tái)的時(shí)間(即逃避潛伏期)。如果大鼠在2 min內(nèi)找到平臺(tái)，記錄其實(shí)際逃避潛伏期;如果在2 min內(nèi)未找到平臺(tái)，由實(shí)驗(yàn)者將其引上平臺(tái)并停留10 s，逃避潛伏期記錄為2 min。2)空間探索試驗(yàn)定位航行試驗(yàn)結(jié)束后撤去平臺(tái)，然后任選一相同入水點(diǎn)將大鼠放入水中，測(cè)其2 min內(nèi)跨躍原平臺(tái)及其余3個(gè)象限相應(yīng)平臺(tái)位置的次數(shù)。

2.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血EPCs數(shù)量 電針實(shí)驗(yàn)組大鼠于每個(gè)治療療程結(jié)束后1 h，眼眶取血。放于EDTA抗凝管，F(xiàn)icocl密度離心梯度法收集單個(gè)核細(xì)胞。分別加入CD34-PC5，CDl33-PE，KDR-FITC3于獲取的單核細(xì)胞樣本中，避光孵育30 min。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞懸液，每份標(biāo)本檢測(cè)20萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，獲得流式細(xì)胞散點(diǎn)圖，從中圈出單個(gè)核細(xì)胞散點(diǎn)區(qū)，對(duì)所圈的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)CD34、CDl33、KDR均為陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量，即內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量。其余3組取血方法與電針?lè)▽?shí)驗(yàn)組相同，時(shí)間上與之平行。

2.3.3 血管新生相關(guān)因子檢測(cè) 電針及西藥治療結(jié)束后，各組大鼠眶靜脈取血,常規(guī)分離血清,ELISA放射免疫方法檢測(cè)VEGF含量；硝酸還原酶法檢測(cè)NO。實(shí)驗(yàn)操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。

3 結(jié)果

3.1 各組水迷宮學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表1。

表1 各組水迷宮學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果±s,n=12)

注：與假手術(shù)組比較，##P<0.01；與空白對(duì)照組比較，△△P<0.01

3.2 各組外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表2。

表2 各組外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)結(jié)果±s,n=12) 個(gè)/20萬(wàn)個(gè)細(xì)胞

注：與空白對(duì)照組比較，#P<0.05，##P<0.01

3.3 各組血清NO/VEGF檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表3。

表3 各組血清NO/VEGF檢測(cè)結(jié)果

注：與假手術(shù)組比較，##P<0.01；與空白對(duì)照組比較，△△P<0.01

4 討論

血管性癡呆屬于“中風(fēng)癡呆病”范疇。電針是中醫(yī)臨床治療VD的常用方法之一。既往研究發(fā)現(xiàn)針灸治療VD，在改善臨床癥狀，降低病死率方面具有肯定的療效。

研究[6-8]顯示，外周血EPCs數(shù)量可作為內(nèi)皮功能和缺血性疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一,增加外周血或缺血腦組織中的EPCs數(shù)量，則有可能促進(jìn)缺血腦組織的側(cè)支循環(huán)重建和血管新生，有利于改善缺血腦組織的血液供應(yīng)，保護(hù)神經(jīng)元，恢復(fù)腦組織的功能，從而提高學(xué)習(xí)記憶能力。NO是眾多血管生長(zhǎng)因子的下游介質(zhì),來(lái)自內(nèi)皮的NO是誘導(dǎo)血管生成所必需的，具有調(diào)節(jié)血管生成因子，刺激血管生成的作用，能夠延長(zhǎng)內(nèi)皮細(xì)胞生命周期，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移力。VEGF被認(rèn)為是最具影響的血管新生活性物質(zhì)，在體外可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生，在體內(nèi)可誘導(dǎo)血管新生，在腦缺血后新生血管形成中起主要作用。故血清VEGF、NO含量可以有效反映腦組織中VEGF、NO的合成狀態(tài)。

本研究結(jié)果顯示，電針能夠改善血管認(rèn)知障礙大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，升高外周血血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量，升高血清NO和VEGF水平。提示電針可能通過(guò)促進(jìn)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖、分化，上調(diào)缺血腦組織中血管生長(zhǎng)因子NO和VEGF表達(dá)，從而促進(jìn)腦微血管新生，恢復(fù)神經(jīng)功能，提高學(xué)習(xí)記憶能力。本研究對(duì)針灸臨床防治VD提供了理論基礎(chǔ)，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

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ElectroacupunctureonlearningmemoryandEPCs,NO,VEGFofvasculardementiarats

QIAN ShanJun1,CHEN Xingsheng2*,ZHOU Ting2,CHENG Hongliang2,ZHANG Wendong2,LI Fei2,CAI Ronglin3,WU Shengbing3,CHEN Guoqing3,WANG Chuxu3,HE Junliang3

(1.Anhui Medical College,Hefei 230601,China;2.Second Affiliated Hospital of Anhui University of Traditional Chinese Medicine,Hefei 230061,China;3.Anhui University of Traditional Chinese Medicine,Hefei 230038,China)

ObjectiveTo observe the effect of electroacupuncture on learning memory ability and the changes of EPC,NO,VEGF in plasma of vascular dementia (VD) rats.MethodsAfter induced by 4-vessle occlusion,morris water maze tests were conducted for evaluating the rats learning-memory ability,the contents of EPCs in plasma were measured by flow cytometry,VEGF was determined by ELISA,NO by Nitrate reductase respectively,and compared to aniracetam.ResultsCompared to the control group,electroacupuncture could elevate the learning and memory ability,increased the content of EPCs,NO and VEGF.ConclusionElectroacupuncture can elevate the learning and memory ability by Promoting angiogenesis.

vascular cognitive impairmet;acupuncture;endothelial progenitor cells;angiogenesis;rat

10.13463/j.cnki.cczyy.2014.05.004

安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(1208085MH126)。

錢善軍,博士,副教授。研究方向:中醫(yī)藥防治老年病。

] 陳幸生，教授，主任醫(yī)師，電話：13866703678，電子信箱：chenxs202@126.com。

R285.5

：A

：2095-6258(2014)05-0770-03

2014-03-19)

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