β—細辛醚對抑郁模型大鼠海馬組織及Bax、Bcl—2的影響

金銘等

【摘要】 目的：探討β-細辛醚對抑郁模型大鼠海馬組織及Bax、Bcl-2蛋白表達的影響。方法：經過敞箱實驗選取得分相近的2～3個月齡SD大鼠80只，按隨機數字表法分為四組，每組20只，結合孤養并給予慢性輕度不可預見刺激，復制抑郁模型，于造模成功第2天開始，分別給予氟西汀組和β-細辛醚組1.2 mg/（kg·d）氟西汀和25 mg/（kg·d）β-細辛醚灌胃，模型組與正常組給予等體積生理鹽水。于第21天對大鼠處死取腦，免疫組織化學法檢測Bax、Bcl-2蛋白相對含量。結果：模型組大鼠海馬組織神經元數目減少，散在排列，細胞核發生固縮變形，CA1區，CA3區變化顯著。與模型組比較，β-細辛醚組、氟西汀組Bax蛋白表達均顯著降低（P<0.01）。結論：β-細辛醚可以降低大鼠海馬組織Bax蛋白表達，促進Bcl-2蛋白表達。

【關鍵詞】 β-細辛醚； 海馬； B細胞淋巴瘤/白血病-2； Bax

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of β-assrone on the hippocampus and the expressions of protein Bax and Bcl-2 in the hippocampus of depression model rats.Method：According to the open field test，adult Sprague-Dawley rates with similar scores were randomly divided into 4 groups， each group had 20 cases. Solitary and chronic mild unpredictability stimulation on each one except the normal control group， copy the model of depression. On the second day of a successful model replication， the fluoxetine control group and the β-asarone group were given 1.2 mg/（kg·d） the fluoxetine and 25 mg/（kg·d） the β-asarone. The model control group and the normal control group were given equal volumes of normal saline. On the 21th day， rats were to be put to death and take brain tissue. The protein expression of Bax and Bcl-2 in the hippocampus were tested by immunohistochemical staining method.Result：The numbers of neurons were reduced in the hippocampus of model group， scattered in the arrangement， the nucleus of neurons were pycnosis deformation，especially on the region of CA1 and CA3. Compared with model group， the protein expression of Bax reduced and Bcl-2 increased with statistical significance in the hippocampus in fluoxetine control group and β-asarone group（P<0.01）.Conclusion：β-asarone can reduce the protein expression of Bax， while promote the protein expression of Bcl-2 in the hippocampus of depression model rats.

【Key words】 β-asarone； Hippocampus； B celll ymphoma/leukemis-2； Bcl-2 associated X protein

First-authors address：Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.18.012

抑郁癥（depression）是臨床較為常見的精神疾病性障礙，病因較為復雜，病程較長，發病率呈逐年上升趨勢[1-2]。中藥石菖蒲具有提神醒腦、開竅益智的作用，是中醫治療腦病常用藥物之一，現代藥理學研究提示，石菖蒲具有較好的抗抑郁作用[3]。本實驗通過研究石菖蒲主要有效成分β-細辛醚對抑郁模型大鼠海馬區的作用，探討其對海馬神經元凋亡因子Bax（Bcl-2 associated X protein，Bax）、B細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemis-2，Bcl-2）表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 2～3個月齡的清潔級雄性SD大鼠，體重180～200 g，由大連醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（遼）2008-0002。

1.1.2 藥品 鹽酸氟西汀膠囊（由蘇州俞氏藥業有限公司提供），β-細辛醚標準品（由天津一方科技有限公司提供）。endprint

1.1.3 其他材料 試劑兔抗鼠Bax抗體（購于Abcam公司）、兔抗鼠Bcl-2抗體（購于Abcam公司）。免疫組化SP試劑盒、DAB顯色劑、PBS緩沖液（購于福州邁新生物技術開發有限公司）。

1.1.4 儀器 光學顯微鏡CX11R BSF（Olympus），圖像分析系統DP801（Alphamiager公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 大鼠適應性喂養1周，自由進食水。保持環境干燥，通風，溫度18～20 ℃，無噪聲，無人為光源。進行敞箱實驗（Open-field-test），選取得分相近的80只大鼠進行分組，按隨機數字表法分為四組：正常組、β-細辛醚組、氟西汀組、模型組，每組20只。

1.2.2 具體方法 除正常組外每籠單只飼養，正常組不給予任何刺激。β-細辛醚組、氟西汀組、模型組，均接受慢性輕度不可預見性應激刺激（Chronic unpredictable mild stress stimulation，CUMS）：每天進行一種不可預知的刺激，持續21 d，每種刺激使用不超過4次，避免大鼠適應刺激，刺激方法根據Katz法改進。具體方法：搖晃（30 min），傾斜鼠籠（45°，24 h），禁食水（24 h），束縛（24 h），熱刺激（45 ℃，5 min），冰水游泳（4 ℃，5 min），夾尾（3 min），潮濕環境（100 g墊料中加入200 mL水，24 h）。造模開始計為第1天。第2天起，β-細辛醚組給予10 g/L的β-細辛醚組混懸液，按25 mg/（kg·d）灌胃給藥。氟西汀組給予10 g/L的氟西汀混懸液，按1.2 mg/（kg·d）灌胃給藥。模型組給予等量生理鹽水，每天灌胃一次。

1.2.3 免疫組織化學法檢測大鼠海馬組織Bax、Bcl-2蛋白表達 石蠟切片脫蠟和水化后進行抗原修復。采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶（SP）法進行免疫組織化學染色，并DAB顯色，經過蘇木素復染、PBS洗滌、鹽酸乙醇分化后返藍，常規脫水、透明、中性樹膠封片。每一張切片在陽性表達區域挑選10個無重疊視野，使用Olympus顯微鏡、DP801形態分析軟件進行圖像采集處理，圖像分析系統進行分析，測出Bax、Bcl-2蛋白抗原表達的總面積、陽性細胞數和平均吸光度IA，計算其積分吸光度。

1.3 統計學處理 運用SPSS 13.0統計學軟件對數據進行處理，計量資料采用（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠海馬區Bax蛋白表達 模型組大鼠海馬區Bax蛋白表達較正常組顯著增強，兩組積分光密度比較差異有統計學意義（P<0.05），β-細辛醚組、氟西汀組與模型組比較積分光密度明顯降低（P<0.05），見圖1、表1。

2.2 各組大鼠海馬區Bcl-2蛋白表達 模型組的Bcl-2蛋白表達明顯低于正常組，積分光密度顯著降低（P<0.05）。β-細辛醚組、氟西汀組積分光密度介于兩者之間，與模型組比較明顯升高（P<0.05），見圖2、表1。

3 討論

抑郁癥的發病率逐年增高，并且呈現年輕化的趨勢。通過孤養大鼠模擬抑郁癥情境，探討抑郁癥的發生與發展機制，是目前一種可靠的研究手段。前期大量試驗證實，CMUS結合孤養模式建立的大鼠抑郁模型，可以穩定的模擬抑郁癥行為學表現[4-5]。并且已經發現抑郁癥的發生與大鼠海馬神經細胞凋亡密切相關[6]。Bcl-2是凋亡蛋白家族中最重要的一種調控蛋白，和Bax、Bad、Bak等共同構成了Bcl-2蛋白家族。有研究證實，Bax/Bcl-2的比值變化趨勢更能描述細胞凋亡發生[7]。其比值升高，說明細胞發生凋亡的可能性增加，反之降低。

該實驗結果表明，模型組經過21 d造模后，產生明顯抑郁癥狀，HE染色示海馬組織發生明顯改變，與前期研究結果一致[8-9]。氟西汀組及β-細辛醚組經過藥物灌胃后，抑郁癥狀減輕，并且抗凋亡蛋白Bcl-2表達增加，促凋亡蛋白Bax表達降低。

抑郁癥的病理機理非常復雜，目前所做的研究基本是基于某一特定通路展開的研究，然而其發生與發展是多種通路共同協作產生的結果，為了更好地結合現有的研究，需要進一步完善各個通路之間的關系，以期找到治療抑郁癥的靶向因子，并使其盡早應用于臨床治療。

參考文獻

[1]張亞軍，王宏哲.帕金森病患者的抑郁與認知功能障礙相關關系分析[J].中國醫學創新，2010，7（30）：1-3.

[2] Palazidou E.The neurobiology of depression[J].Br Med Bull，2012，101（1）：127-145.

[3]李明亞，李娟好，季寧東，等.石菖蒲幾種粗提取物的抗抑郁作用[J].廣東藥學院學報，2004，20（2）：141.

[4]孟盼，王宇紅，張秀麗，等.百事樂膠囊對慢性應激抑郁模型大鼠海馬神經元凋亡的影響[J].中國實驗方劑學，2013，19（19）：203-207.

[5]孫玉榮，董海影，王顯艷，等.β-細辛醚對抑郁模型大鼠行為及海馬神經元的影響[J].北京中醫藥大學學報，2013，36（8）：546-549.

[6] Zhou Q G，Hu Y，Wu D L，et al.Hippocampal Telomerase Is Involved in the Modulation of Depressive Behaviors[J].The Journal of Neuroscience，2011，31（34）：12 258-12 269.

[7]白巨利，孟紫強.p53、bax和bcl-2基因在SO2染毒大鼠肝中的表達[J].中國生物化學與分子生物學報，2006，22（4）：343-348.

[8]榮華，董海影，張靜艷，等.β-細辛醚對抑郁模型大鼠海馬CA3區超微改變及腦組織ERK蛋白表達的影響[J].中國醫學創新，2013，10（36）：10-12.

[9] Richard J P，Christopher R B，Jennifer J，et al.Cognitive remediation as a treatment for major depression： a rationale， review of evidence and recommendations for future research[J].Australian and New Zealand Journal of Psychiatry，2013，47（12）：1165-1175.

（收稿日期：2014-04-21） （本文編輯：蔡元元）endprint

1.1.3 其他材料 試劑兔抗鼠Bax抗體（購于Abcam公司）、兔抗鼠Bcl-2抗體（購于Abcam公司）。免疫組化SP試劑盒、DAB顯色劑、PBS緩沖液（購于福州邁新生物技術開發有限公司）。

1.1.4 儀器 光學顯微鏡CX11R BSF（Olympus），圖像分析系統DP801（Alphamiager公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 大鼠適應性喂養1周，自由進食水。保持環境干燥，通風，溫度18～20 ℃，無噪聲，無人為光源。進行敞箱實驗（Open-field-test），選取得分相近的80只大鼠進行分組，按隨機數字表法分為四組：正常組、β-細辛醚組、氟西汀組、模型組，每組20只。

1.2.2 具體方法 除正常組外每籠單只飼養，正常組不給予任何刺激。β-細辛醚組、氟西汀組、模型組，均接受慢性輕度不可預見性應激刺激（Chronic unpredictable mild stress stimulation，CUMS）：每天進行一種不可預知的刺激，持續21 d，每種刺激使用不超過4次，避免大鼠適應刺激，刺激方法根據Katz法改進。具體方法：搖晃（30 min），傾斜鼠籠（45°，24 h），禁食水（24 h），束縛（24 h），熱刺激（45 ℃，5 min），冰水游泳（4 ℃，5 min），夾尾（3 min），潮濕環境（100 g墊料中加入200 mL水，24 h）。造模開始計為第1天。第2天起，β-細辛醚組給予10 g/L的β-細辛醚組混懸液，按25 mg/（kg·d）灌胃給藥。氟西汀組給予10 g/L的氟西汀混懸液，按1.2 mg/（kg·d）灌胃給藥。模型組給予等量生理鹽水，每天灌胃一次。

1.2.3 免疫組織化學法檢測大鼠海馬組織Bax、Bcl-2蛋白表達 石蠟切片脫蠟和水化后進行抗原修復。采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶（SP）法進行免疫組織化學染色，并DAB顯色，經過蘇木素復染、PBS洗滌、鹽酸乙醇分化后返藍，常規脫水、透明、中性樹膠封片。每一張切片在陽性表達區域挑選10個無重疊視野，使用Olympus顯微鏡、DP801形態分析軟件進行圖像采集處理，圖像分析系統進行分析，測出Bax、Bcl-2蛋白抗原表達的總面積、陽性細胞數和平均吸光度IA，計算其積分吸光度。

1.3 統計學處理 運用SPSS 13.0統計學軟件對數據進行處理，計量資料采用（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠海馬區Bax蛋白表達 模型組大鼠海馬區Bax蛋白表達較正常組顯著增強，兩組積分光密度比較差異有統計學意義（P<0.05），β-細辛醚組、氟西汀組與模型組比較積分光密度明顯降低（P<0.05），見圖1、表1。

2.2 各組大鼠海馬區Bcl-2蛋白表達 模型組的Bcl-2蛋白表達明顯低于正常組，積分光密度顯著降低（P<0.05）。β-細辛醚組、氟西汀組積分光密度介于兩者之間，與模型組比較明顯升高（P<0.05），見圖2、表1。

3 討論

抑郁癥的發病率逐年增高，并且呈現年輕化的趨勢。通過孤養大鼠模擬抑郁癥情境，探討抑郁癥的發生與發展機制，是目前一種可靠的研究手段。前期大量試驗證實，CMUS結合孤養模式建立的大鼠抑郁模型，可以穩定的模擬抑郁癥行為學表現[4-5]。并且已經發現抑郁癥的發生與大鼠海馬神經細胞凋亡密切相關[6]。Bcl-2是凋亡蛋白家族中最重要的一種調控蛋白，和Bax、Bad、Bak等共同構成了Bcl-2蛋白家族。有研究證實，Bax/Bcl-2的比值變化趨勢更能描述細胞凋亡發生[7]。其比值升高，說明細胞發生凋亡的可能性增加，反之降低。

該實驗結果表明，模型組經過21 d造模后，產生明顯抑郁癥狀，HE染色示海馬組織發生明顯改變，與前期研究結果一致[8-9]。氟西汀組及β-細辛醚組經過藥物灌胃后，抑郁癥狀減輕，并且抗凋亡蛋白Bcl-2表達增加，促凋亡蛋白Bax表達降低。

抑郁癥的病理機理非常復雜，目前所做的研究基本是基于某一特定通路展開的研究，然而其發生與發展是多種通路共同協作產生的結果，為了更好地結合現有的研究，需要進一步完善各個通路之間的關系，以期找到治療抑郁癥的靶向因子，并使其盡早應用于臨床治療。

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[3]李明亞，李娟好，季寧東，等.石菖蒲幾種粗提取物的抗抑郁作用[J].廣東藥學院學報，2004，20（2）：141.

[4]孟盼，王宇紅，張秀麗，等.百事樂膠囊對慢性應激抑郁模型大鼠海馬神經元凋亡的影響[J].中國實驗方劑學，2013，19（19）：203-207.

[5]孫玉榮，董海影，王顯艷，等.β-細辛醚對抑郁模型大鼠行為及海馬神經元的影響[J].北京中醫藥大學學報，2013，36（8）：546-549.

[6] Zhou Q G，Hu Y，Wu D L，et al.Hippocampal Telomerase Is Involved in the Modulation of Depressive Behaviors[J].The Journal of Neuroscience，2011，31（34）：12 258-12 269.

[7]白巨利，孟紫強.p53、bax和bcl-2基因在SO2染毒大鼠肝中的表達[J].中國生物化學與分子生物學報，2006，22（4）：343-348.

[8]榮華，董海影，張靜艷，等.β-細辛醚對抑郁模型大鼠海馬CA3區超微改變及腦組織ERK蛋白表達的影響[J].中國醫學創新，2013，10（36）：10-12.

[9] Richard J P，Christopher R B，Jennifer J，et al.Cognitive remediation as a treatment for major depression： a rationale， review of evidence and recommendations for future research[J].Australian and New Zealand Journal of Psychiatry，2013，47（12）：1165-1175.

（收稿日期：2014-04-21） （本文編輯：蔡元元）endprint

1.1.3 其他材料 試劑兔抗鼠Bax抗體（購于Abcam公司）、兔抗鼠Bcl-2抗體（購于Abcam公司）。免疫組化SP試劑盒、DAB顯色劑、PBS緩沖液（購于福州邁新生物技術開發有限公司）。

1.1.4 儀器 光學顯微鏡CX11R BSF（Olympus），圖像分析系統DP801（Alphamiager公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 大鼠適應性喂養1周，自由進食水。保持環境干燥，通風，溫度18～20 ℃，無噪聲，無人為光源。進行敞箱實驗（Open-field-test），選取得分相近的80只大鼠進行分組，按隨機數字表法分為四組：正常組、β-細辛醚組、氟西汀組、模型組，每組20只。

1.2.2 具體方法 除正常組外每籠單只飼養，正常組不給予任何刺激。β-細辛醚組、氟西汀組、模型組，均接受慢性輕度不可預見性應激刺激（Chronic unpredictable mild stress stimulation，CUMS）：每天進行一種不可預知的刺激，持續21 d，每種刺激使用不超過4次，避免大鼠適應刺激，刺激方法根據Katz法改進。具體方法：搖晃（30 min），傾斜鼠籠（45°，24 h），禁食水（24 h），束縛（24 h），熱刺激（45 ℃，5 min），冰水游泳（4 ℃，5 min），夾尾（3 min），潮濕環境（100 g墊料中加入200 mL水，24 h）。造模開始計為第1天。第2天起，β-細辛醚組給予10 g/L的β-細辛醚組混懸液，按25 mg/（kg·d）灌胃給藥。氟西汀組給予10 g/L的氟西汀混懸液，按1.2 mg/（kg·d）灌胃給藥。模型組給予等量生理鹽水，每天灌胃一次。

1.2.3 免疫組織化學法檢測大鼠海馬組織Bax、Bcl-2蛋白表達 石蠟切片脫蠟和水化后進行抗原修復。采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶（SP）法進行免疫組織化學染色，并DAB顯色，經過蘇木素復染、PBS洗滌、鹽酸乙醇分化后返藍，常規脫水、透明、中性樹膠封片。每一張切片在陽性表達區域挑選10個無重疊視野，使用Olympus顯微鏡、DP801形態分析軟件進行圖像采集處理，圖像分析系統進行分析，測出Bax、Bcl-2蛋白抗原表達的總面積、陽性細胞數和平均吸光度IA，計算其積分吸光度。

1.3 統計學處理 運用SPSS 13.0統計學軟件對數據進行處理，計量資料采用（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠海馬區Bax蛋白表達 模型組大鼠海馬區Bax蛋白表達較正常組顯著增強，兩組積分光密度比較差異有統計學意義（P<0.05），β-細辛醚組、氟西汀組與模型組比較積分光密度明顯降低（P<0.05），見圖1、表1。

2.2 各組大鼠海馬區Bcl-2蛋白表達 模型組的Bcl-2蛋白表達明顯低于正常組，積分光密度顯著降低（P<0.05）。β-細辛醚組、氟西汀組積分光密度介于兩者之間，與模型組比較明顯升高（P<0.05），見圖2、表1。

3 討論

抑郁癥的發病率逐年增高，并且呈現年輕化的趨勢。通過孤養大鼠模擬抑郁癥情境，探討抑郁癥的發生與發展機制，是目前一種可靠的研究手段。前期大量試驗證實，CMUS結合孤養模式建立的大鼠抑郁模型，可以穩定的模擬抑郁癥行為學表現[4-5]。并且已經發現抑郁癥的發生與大鼠海馬神經細胞凋亡密切相關[6]。Bcl-2是凋亡蛋白家族中最重要的一種調控蛋白，和Bax、Bad、Bak等共同構成了Bcl-2蛋白家族。有研究證實，Bax/Bcl-2的比值變化趨勢更能描述細胞凋亡發生[7]。其比值升高，說明細胞發生凋亡的可能性增加，反之降低。

該實驗結果表明，模型組經過21 d造模后，產生明顯抑郁癥狀，HE染色示海馬組織發生明顯改變，與前期研究結果一致[8-9]。氟西汀組及β-細辛醚組經過藥物灌胃后，抑郁癥狀減輕，并且抗凋亡蛋白Bcl-2表達增加，促凋亡蛋白Bax表達降低。

抑郁癥的病理機理非常復雜，目前所做的研究基本是基于某一特定通路展開的研究，然而其發生與發展是多種通路共同協作產生的結果，為了更好地結合現有的研究，需要進一步完善各個通路之間的關系，以期找到治療抑郁癥的靶向因子，并使其盡早應用于臨床治療。

參考文獻

[1]張亞軍，王宏哲.帕金森病患者的抑郁與認知功能障礙相關關系分析[J].中國醫學創新，2010，7（30）：1-3.

[2] Palazidou E.The neurobiology of depression[J].Br Med Bull，2012，101（1）：127-145.

[3]李明亞，李娟好，季寧東，等.石菖蒲幾種粗提取物的抗抑郁作用[J].廣東藥學院學報，2004，20（2）：141.

[4]孟盼，王宇紅，張秀麗，等.百事樂膠囊對慢性應激抑郁模型大鼠海馬神經元凋亡的影響[J].中國實驗方劑學，2013，19（19）：203-207.

[5]孫玉榮，董海影，王顯艷，等.β-細辛醚對抑郁模型大鼠行為及海馬神經元的影響[J].北京中醫藥大學學報，2013，36（8）：546-549.

[6] Zhou Q G，Hu Y，Wu D L，et al.Hippocampal Telomerase Is Involved in the Modulation of Depressive Behaviors[J].The Journal of Neuroscience，2011，31（34）：12 258-12 269.

[7]白巨利，孟紫強.p53、bax和bcl-2基因在SO2染毒大鼠肝中的表達[J].中國生物化學與分子生物學報，2006，22（4）：343-348.

[8]榮華，董海影，張靜艷，等.β-細辛醚對抑郁模型大鼠海馬CA3區超微改變及腦組織ERK蛋白表達的影響[J].中國醫學創新，2013，10（36）：10-12.

[9] Richard J P，Christopher R B，Jennifer J，et al.Cognitive remediation as a treatment for major depression： a rationale， review of evidence and recommendations for future research[J].Australian and New Zealand Journal of Psychiatry，2013，47（12）：1165-1175.

（收稿日期：2014-04-21） （本文編輯：蔡元元）endprint