基于改進QuEChERS法聯合超高效液相色譜-質譜法的人參中禁用農藥殘留分析△

武曉麗，丁自勉*，柯潤輝

1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193；

2.中輕檢驗認證有限公司，北京 100015

QuEChERS 是quick、easy、cheap、effective、rugged、safe的縮寫，意即快速、簡單、廉價、有效、堅固耐用和安全，是由美國科學家2003 年開發的一種用于蔬菜、水果中農藥多殘留測定的樣品前處理方法，包括乙腈提取/分離和分散固相萃取凈化2個主要過程[1]。為了使QuEChERS對復雜基質和分析物有更好的萃取效果，研究人員主要針對萃取鹽析和吸附劑2 個關鍵因素進行優化[2]。前者由原始的非緩沖鹽版本演化為2個官方分析方法，即以醋酸鹽為緩沖液的美國AOAC 官方分析方法2007.01[3]和以檸檬酸鹽為緩沖液的歐盟官方方法EN15662[4]。在吸附劑優化方面，主要評估不同吸附劑的凈化效果[5]，如N-丙基乙二胺（PSA）通常用于去除脂肪酸、糖、有機酸和一些色素；十八烷基鍵合硅膠（C18）可有效地去除高脂樣品；石墨化碳黑（GCB）主要去除共提色素（如葉綠素和類胡蘿卜素等）；無水硫酸鎂用于去除水分。經過改進后，QuEChERS 能夠減少不穩定農藥分解、減弱基質效應和提高農藥回收率。

近年來，QuEChERS 在中藥農藥殘留檢測中的應用也日漸普及。例如，用無水硫酸鎂1200 mg、C18100 mg、PSA 300 mg為凈化劑，建立了廣陳皮中39 種禁用農藥的氣相色譜-質譜法（GC-MS/MS）檢測[6]；用商業化的QuEChERS 提取包和凈化管，建立了貝母類藥材中53種農藥殘留GC-MS/MS測定[7]。但是中藥種類眾多、基質復雜，除了富含色素、有機酸等基質外，還含有黃酮、萜、皂苷等類的藥理活性成分[8]，經典的QuEChERS 凈化包可能會吸附一部分農藥，造成回收率下降[9]，因此，需要對凈化劑的種類和配比進行調整。例如，在建立白芷中禁用農藥殘留檢測方法時發現，因白芷藥材中植物色素量較少，GCB 會吸附平面型農藥，導致其回收率降低[10]；閆君等[11]針對當歸中色素含量低，含有揮發油等特點，選擇無水硫酸鎂800 mg、PSA 150 mg和C18150 mg 進行凈化，能夠減弱基質效應，試驗的102種農藥的回收率為52%～128%。

隨著《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版的實施，QuEChERS成為藥材及飲片（植物類）中禁用農藥多殘留測定法的樣品制備標準方法之一，其中分散固相萃取凈化劑為無水硫酸鎂900 mg、PSA 300 mg、C18300 mg、硅膠300 mg、GCB 90 mg[12]。但是在日常檢測中，本研究團隊發現上述吸附劑配比會造成一些禁用農藥（如殺蟲脒、甲磺隆、胺苯磺隆、氯磺隆）回收率偏低的問題。這可能是由于在部分中藥基質中，某些吸附劑對目標農藥產生吸附，因此需要對吸附劑配比進行調整。但目前尚未有針對上述現象的系統研究。

人參是一種常用的藥食兩用中藥材，《中國藥典》 2020 年版記載其為五加科植物人參Panax ginsengC.A.Mey.的干燥根和根莖，具有大補元氣、復脈固脫、補脾益肺、生津養血、安神益智的功效[13]。本研究以人參為例，對QuEChERS 吸附劑用量配比進行優化，用超高效液相色譜-質譜法（UPLC-MS/MS）對30 種禁用農藥進行檢測，并對方法的回收率、重復性、線性等指標進行考察。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；5500QTRAP型質譜儀（美國AB SCⅠEX公司）；SiO-7512 型自動QuEChERS 樣品制備系統（北京本立科技有限公司）。

1.2 試藥

人參藥材購于安國藥材市場，由中國醫學科學院藥用植物研究所李國強副研究員鑒定為人參Panax ginsengC.A.Mey.，粉碎后過三號篩，置于-20 ℃冰箱中，備用；色譜純乙腈和質譜級甲酸購自美國Fisher 公司；分析純無水硫酸鎂、無水醋酸鈉購自國藥集團化學試劑有限公司；C18、PSA、硅膠、GCB 購自上海安譜實驗科技股份有限公司；禁用農藥混合對照品（批號：CDAA-M-490407-TX，2～20 mg·L-1）購自上海安譜璀世標準技術服務有限公司，用前取0.5 mL稀釋至10 mL（0.1～1.0 mg·L-1），置于-20 ℃冰箱中，備用。

2 方法

2.1 UPLC-MS/MS條件

2.1.1色譜條件 Thermo Scientific Hypersil GOLD色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0～0.5 min，30%A；0.5～9.0 min，30%～90%A；9.0～13.0 min，90%A；13.0～14.0 min，90%～30%A；14.0～18.0 min，30%A）；流速為0.20 mL·min-1，柱溫為30 ℃，進樣量為2 μL。

2.1.2質譜條件 電噴霧離子源（ESⅠ），監測模式為多反應監測（MRM），正離子掃描；離子噴霧電壓（ⅠS）+5.5 kV；離子源溫度550 ℃，霧化氣（GS1）壓力50 psi（1 psi≈6.895 kPa），輔助氣（GS2）壓力50 psi，氣簾氣（CUR）壓力35 psi。監測離子對、碰撞電壓（CE）等參照《中國藥典》2020年版，并根據儀器條件稍作調整（表1）。

表1 人參中各農藥的tR、監測離子對及CE

2.2 樣品前處理

2.2.1QuEChERS 樣品前處理 參照《中國藥典》（四部）2341農藥殘留量測定法第五法[12]：稱取人參粉末3 g，加入1%冰醋酸溶液15 mL，渦旋使浸潤，放置30 min，加入無水硫酸鎂與無水硫酸鈉共7.5 g（4∶1）后立即搖散，振蕩3 min，冰浴10 min，離心5 min（4000 r·min-1，離心半徑為9.5 cm）。取上清液9 mL，置裝有凈化劑的分散固相萃取凈化管中，渦旋混勻，劇烈振蕩5 min 凈化，離心5 min（4000 r·min-1，離心半徑為9.5 cm）。精密吸取上清液5 mL，氮吹濃縮至約0.4 mL，加乙腈稀釋至1.0 mL，精密加入水0.3 mL，混勻，過0.22 μm 濾膜，取續濾液待測。

2.2.2對照品溶液制備 取混合對照品0.5 mL 稀釋至10 mL（0.1～1.0 mg·L-1），置于-20 ℃冰箱中，備用。

2.2.3吸附劑種類優化 分別使用1）經典分散固相萃取混合凈化管（含無水硫酸鎂900 mg、PSA 300 mg、C18300 mg、硅膠300 mg、GCB 90 mg）；2）PSA 300 mg和無水硫酸鎂900 mg；3）C18300 mg和無水硫酸鎂900 mg；4）硅膠300 mg和無水硫酸鎂900 mg；5）GCB 90 mg 和無水硫酸鎂900 mg；6）無水硫酸鎂900 mg 的凈化管對提取的人參基質進行凈化處理，其他處理過程同2.2.1項。

2.2.4硅膠、C18和PSA 用量優化 在前期研究基礎上，發現硅膠、C18和PSA 會造成部分農藥回收率下降，因此進一步對其進行減量優化。當硅膠、C18和PSA 分別均為300、250、200、150、100 mg 時，考察農藥的回收率。

2.3 加樣回收試驗和精密度

精密稱定人參粉末3 g，分別添加禁用農藥混合對照品（0.1～1.0 mg·L-1）30、300、600 μL，平行6次，按照2.2項下優化好的吸附劑用量進行樣品處理，考察方法的回收率和相對標準偏差（RSD)。

2.4 方法的線性、定量下限（LLOQ）和基質效應（ME）

取人參樣品粉末3 g，按照2.3項下方法制備空白溶液。取空白基質溶液1.0 mL（6份），氮吹濃縮至約0.6 mL，分別加入混合對照品溶液10、20、50、100、150、200 μL，加乙腈稀釋至1.0 mL，渦旋混勻，即得基質匹配對照品。以質量濃度為橫坐標（X），以峰面積為縱坐標（Y），通過計算和擬合得到標準曲線的線性方程、線性相關系數（r）。按照公式（1）計算農藥殘留分析中ME[9]。取標準曲線最低點，計算照信噪比為10∶1時的相應濃度為LLOQ。

ME=（基質匹配標準曲線的斜率/溶劑標準曲線斜率-1）×100% （1）

3 結果與分析

3.1 吸附劑種類優化

人參提取液經過2.2.3項下6種不同凈化管處理后，30種禁用農藥回收率結果見圖1。第1～6種處理方式下，30 種禁用農藥的回收率分別為59.6%～100.3%、68.8%～100.2%、75.2%～103.0%、60.8%～100.8%、84.7%～100.3%、82.6%～101.2%。經過商業化分散固相萃取混合凈化管凈化后，殺蟲脒、甲磺隆、胺苯磺隆、氯磺隆的回收率都低于80%，分別為59.6%、69.8%、77.2%和61.4%；經過PSA 300 mg和MgSO4900 mg凈化后，甲磺隆和氯磺隆的回收率低于80%，分別為76.6%、68.8%；經過C18300 mg或者硅膠300 mg凈化后，殺蟲脒的回收率均低于80%，分別為75.2%和60.8%；而經過GCB 90 mg 和無水硫酸鎂900 mg 凈化后，能夠有效去除人參中少量色素，且所有農藥的回收率都在80%以上；經過無水硫酸鎂900 mg 凈化后，所有農藥的回收率都在80%以上，表明無水硫酸鎂不會造成農藥回收率降低。因此，推測可能是因為PSA對甲磺隆、胺苯磺隆、氯磺隆等磺酰脲類除草劑有吸附作用，C18和硅膠對殺蟲脒有吸附作用，造成這些農藥的回收率降低。因此，進一步對這3 種吸附劑用量進行了優化，并對吸附機制進行探討。

圖1 不同凈化劑處理后30種禁用農藥回收率

3.2 硅膠、C18和PSA用量優化

硅膠表面有大量的羥基，有較強的極性，可以用于除去極性較大的雜質。C18表面有非極性碳鏈和部分未鍵合的硅醇官能團，可以除去非極性雜質和一些極性雜質。結果顯示（圖2A），隨著C18和硅膠用量的減少，殺蟲脒的回收率都逐漸增加。當硅膠用量從300 mg 減少到100 mg 時，殺蟲脒回收率從60.8%逐漸提高到96.8%，尤其是當硅膠用量＞250 mg 時，殺蟲脒的回收率＜70%。當C18從300 mg減少到100 mg 時，殺蟲脒回收率從75.2%提高到86.5%，當C18用量＜200 mg 時，殺蟲脒回收率＞80%。結果表明，過量的硅膠和C18都會對殺蟲脒有吸附作用，且硅膠的吸附作用更強。推測可能是硅膠上未鍵合的羥基與極性較強的殺蟲脒之間有吸附作用，C18和硅膠相比由于羥基的鍵合而對殺蟲脒的吸附作用減弱。綜上所述，C18和硅膠用于中藥禁用農藥殘留凈化時，應根據基質的種類不同，減少用量。例如，在人參基質中，當C18用量為100～150 mg、硅膠用量為100 mg 時，殺蟲脒有較好的回收率（＞80%）。

PSA 是氨基吸附劑，其2 個氨基的酸度系數（pKa）分別為10.9、10.1[14]，能夠吸附酸性雜質，可以用于樣品中有機酸、脂肪酸及部分色素等基質的去除，但是過量的PSA 有可能會造成酸性農藥的回收率降低。胺苯磺隆、甲磺隆、氯磺隆的pKa 依次為4.20、3.75、3.40，都屬于弱酸性農藥。如圖2B 所示，當PSA 用量＜200 mg 時，3 種磺酰脲類除草劑的回收率都達到80%以上。當PSA 從300 mg減少到100 mg 時，甲磺隆的回收率從76.5%增加到97.3%，胺苯磺隆回收率從83.6% 增加到100.6%，氯磺隆回收率從68.8%增加到104.9%。這可能是由于過量的PSA 和磺酰脲類除草劑上的氨基能夠形成很強的吸附作用，導致甲磺隆、胺苯磺隆、氯磺隆的回收率降低。實驗中還發現，同等用量的PSA 時，農藥的回收率胺苯磺隆＞甲磺隆＞氯磺隆，這可能是由于3 種農藥的酸性依次增強（pKa 越小，酸性越強），與PSA 的吸附作用也增強，導致回收率降低。因此，當PSA 用于磺酰脲類農藥的樣品凈化時，需要針對不同的基質，減少PSA 用量。

圖2 農藥吸附劑用量優化

綜上所述，在按照《中國藥典》2020 年版中的QuEChERS（無水硫酸鎂900 mg、PSA 300 mg、C18300 mg、硅膠300 mg、GCB 90 mg 作為凈化吸附劑）對人參中禁用農藥進行檢測時，發現C18和硅膠會使殺蟲脒回收率降低，PSA 會使甲磺隆、胺苯磺隆、氯磺隆回收率降低，因此需要減少硅膠、C18和PSA 的用量。當硅膠、C18和PSA 用量為100～150 mg時，殺蟲脒、甲磺隆、胺苯磺隆、氯磺隆有較好的回收率（＞80%）。下面以硅膠100 mg、C18150 mg、PSA 150 mg 和GCB 90 mg 為例，用于人參基質中禁用農藥的殘留分析，考察方法的應用效果。

3.3 加樣回收率和精密度

按照《中國藥典》2020 年版規定，30 種禁用農藥殘留的限度值為0.02～0.20 mg·kg-1[12]，選擇1/10限量值、限量值、2 倍限量值3 個添加水平，平行6次，在3.1、3.2項下優化好的條件下，考察方法準確性和重復性。30 種農藥的回收率和RSD 見表2，回收率為76.4%～108.0%，RSD 為0.9%～7.8%，能夠滿足分析方法的要求。

表2 人參中30種禁用農藥的添加回收率和RSD

續表2

3.4 方法的線性和定量下限

30 種農藥在人參基質中含量的線性范圍、線性方程、r及LLOQ見表3。r為0.993 9～0.999 9，均大于0.990，有較好的線性。所有農藥的LLOQ均低于《中國藥典》2020 年版定量限，能夠用于30 種禁用農藥殘留的定量檢測。

表3 人參中30種農藥殘留測定方法的線性和定量下限

3.5 ME

ME 在痕量分析中對結果的準確度有顯著的影響。ME＞0 表示基質增強效應，ME＜0 表示基質減弱效應；ME＞50%或者＜-50%，表示有較強的基質效應；20%＜ME＜50%，或者-50%＜ME＜-20%，表示中等的基質效應；當ME 在-20%～20%時，表示較弱或者可以忽略不計的基質效應。30 種禁用農藥在人參中的基質效應結果見圖3。人參基質中有8種農藥為基質增強效應（ME＞0），22 種農藥為基質抑制效應（ME＜0）。有2 種農藥呈現較強的基質效應，分別為苯線磷（51.4%）、水胺硫磷（-70.4%）。有9 種農藥呈現中等的基質效應，如甲胺磷、甲磺隆等。有19 種農藥（如殺蟲脒、久效磷、3-羥基克百威等）呈現較弱或者可以忽略不計的基質效應。

圖3 人參中30種禁用農藥的基質效應

4 結論

本研究以人參為例，優化了QuEChERS 用于中藥禁用農藥殘留樣品前處理的凈化劑種類和用量，并對可能的吸附機制進行了探討。結果表明，過量的硅膠和C18會造成殺蟲脒回收率降低，PSA 會造成甲磺隆、氯磺隆、胺苯磺隆等酸性農藥回收率降低。對凈化劑用量進行優化后，30 種禁用農藥的回收率都能夠滿足要求，且方法有較好的精密度、線性和定量限。本研究在不更換吸附劑種類的情況下，對吸附劑用量進行配比優化，彌補經典QuEChERS 的不足，為其在中藥農藥殘留，尤其是禁用農藥殘留的檢測應用提供方法參考。