20味中草藥對3種奶牛乳腺炎致病菌的體外抑菌試驗

劉春杰等

【摘 要】本試驗采用瓊脂平板打孔灌藥法，根據中獸醫理論選擇當歸、川芎、金銀花等20味中草藥對奶牛乳腺炎3種主要致病菌進行體外抑菌試驗。并測定所篩選的11味中藥的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）。試驗結果表明，當歸、川芎、蒲公英、川紅花、白術、金銀花6味中藥對奶牛乳腺炎3種病原菌的綜合抑菌效果較好，此結果為進一步研制治療奶牛乳腺炎復方中藥制劑提供實驗數據。

【關鍵詞】中草藥；奶牛乳腺炎；病原菌；抑菌試驗

【Abstract】This study was adopted flat hole filling method， selected the Angelica， Chuanxiong， Dandelion， Honeysuckle and other 20 kinds of herbal medicine on the cow mastitis causing 3 kinds of main pathogenic bacteria in vitro antibacterial test. Determination of minimum inhibitory concentration and the screening of 11 traditional Chinese medicines and two groups of formula （MIC） and minimum bactericidal concentration （MBC）. The test results show that 3 kinds of pathogenic bacteria of dairy cow mastitis can be effectly suppressed by Angelica， Chuanxiong， Dandelion， Safflower， Atractylodes， Honeysuckle. It will could be provide experimental data for the further development of the treatment of mastitis compound Chinese medicine preparation.

【Key words】Chinese herbs；Dairy cow mastitis； Pathogenic bacteria； Antibacterial test

奶牛乳腺炎是危害奶牛養殖業最常見的疾病之一，雖然對其研究已經有150多年的歷史，取得了一些令人可喜的成果，但仍然是當今奶牛場難以控制的疾病，給奶牛養殖帶來巨大的經濟損失，包括治療費用、牛奶廢棄增加的勞動量、奶產量的下降、母牛過早淘汰、奶品質下降等。據報道引起奶牛乳腺炎的主要致病菌有金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鏈球菌等。自抗生素在臨床應用以來，人們大量應用抗生素治療奶牛乳腺炎，使該病的防治有了巨大的突破。由于抗生素的濫用致使病原菌的抗藥性增強且導致高藥物殘留等問題的發生[1]。中草藥屬于天然藥物，對人類及動物無毒副作用且不易產生抗藥性，藥物殘留相對低等優勢。因此篩選對病原微生物抑菌強度大、特異性高、對環境穩定的中草藥來防治奶牛乳腺炎是發展奶牛業的一項重要課題。本試驗目的在于篩選對奶牛乳腺炎致病菌敏感的中草藥，為中獸醫臨床防治乳腺炎打下基礎[2]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌，鏈球菌是本研究室從長春及其周邊地區患乳腺炎奶牛的牛乳中分離純化鑒定得到。

1.1.2 藥物

金銀花、大青葉、川紅花、蒲公英、桃仁、訶子、秦皮、炮姜、益母草、當歸、白芍、枳殼、紅花、黃芩、黃芪、熟地、魚腥草、地榆等均購自長春市吉林大藥房。

1.1.3 主要器材

上海智誠生化培養箱、蘇州凈化設備有限公司超凈工作臺，青島海爾4℃冰箱、德國賽多利斯電子天平、日本三洋立式高壓滅菌鍋、上海新苗數顯式鼓風干燥箱、可調溫電爐、電子恒溫水浴鍋、高速離心機、旋轉蒸發儀、移液槍等。

1.1.4 藥品與試劑

營養瓊脂、營養肉湯、小牛血清的制備按有關文獻進行[3]。

1.2 方法

1.2.1 中藥制備

分別取20味中草藥各100g，首次加水1000mL，浸泡2h后煮沸，后文火煮60min。4層紗布濾過藥液。所剩濾渣加水500mL再次煎煮60 min，濾過并棄去藥渣，合并2次濾過藥液，經過蒸發、抽濾、烘干，濃縮至50mL，使其終濃度為1g/mL，濃縮后分別裝入有塞廣口瓶，用封口膜封口，貼上標簽，120℃30min滅菌，-20℃凍存。正式試驗時用生理鹽水配成所需濃度，4℃保存待用[1， 4-5]。

1.2.2 菌種培養

試驗所用金黃色葡萄球菌和大腸桿菌擴增采用普通肉湯培養基進行，用2%小牛血營養肉湯培養基擴增培養鏈球菌。菌株接種后置于37℃培養箱中培養24h，待菌種復壯后使用。將復壯后的大腸桿菌接種到含10mL肉湯培養基的試管中，37℃恒溫培養6h；金黃色葡萄球菌接種到含l0mL肉湯培養基的試管中，37℃恒溫培養18h；鏈球菌接種到10mL血清肉湯培養基的試管中，37℃恒溫培養18h。將肉湯培養擴增的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌用肉湯培養基進行1：500稀釋備用。鏈球菌用小牛血清肉湯培養基進行l：5稀釋備用[6]。

1.2.3 20種中草藥體外抑菌試驗

體外抑菌試驗采用瓊脂平板打孔灌藥法進行。取稀釋后的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌液各200μL，用“L”型玻璃棒均勻涂抹于普通瓊脂平板上；鏈球菌200μL均勻涂于小牛血清瓊脂板上。然后待菌液被吸收后在平板上用直徑為6mm打孔器打孔4孔/板，孔間距為20mm，挖出瓊脂，注入受試藥液40μL/孔，每藥2個重復對照孔加蒸餾水，37℃培養24h后分別測量抑菌圈直徑大小，每孔測量2次，最終取兩孔共4次直徑測量的平均值[3]。

1.2.4 結果判定標準

抑菌圈直徑Ф≥16mm為極度敏感；16mm≥Ф≥10mm為高度敏感；10mm≥Ф≥7mm小于為低敏感；7mm≥Ф為不敏感；無抑菌圈為耐藥[8]。

1.2.5 最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）測定

從體外抑菌試驗中選出11味對3種致病菌高度敏感的中藥采用試管法測定其MIC和MBC[4]。每種藥液用10支試管。試管中注入普通營養肉湯（用于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌）或血清營養肉湯（用于鏈球菌）lmL。將lmL滅菌藥液注入第l支試管，用移液槍吹打3下，混勻后吸取1ml注入第2支試管，倍比稀釋，依此類推，到第9管時吸出1mL棄掉，第10管不加藥液只加1mL純培養基。隨后分別在這10個試管中注入0.1mL菌液（含菌量為107/mL），吹打混和均勻。置37℃培養24h后觀察混濁度。從試管外觀察，透明、無混濁為此藥最小抑菌濃度（MIC）。從其中吸取10μL培養物接種于小牛血清瓊脂平板上，37℃培養36h計數菌落數。3個視野無菌落為無菌生長。此管中藥物的濃度為此藥的最小殺菌濃度。

2 結果

2.1 20味中藥體外抑菌試驗結果

從表1看出：川紅花、金銀花、白術、黃芩、茯苓、當歸、川芎對3種病原菌都有不同程度的抑菌作用；熟地、大青葉、白芍、地榆僅對金葡菌和鏈球菌有抑菌作用；枳殼僅對金葡菌和大腸桿菌有抑菌作用，對鏈球菌無抑菌作用。

2.2 11味中藥的MIC和MBC的測定結果

11種中藥的MIC和MBC的測定結果見表2。

由表2可以看出，當歸、川芎、蒲公英、川紅花、白術、金銀花對3種病原菌都有明顯的殺滅效果。熟地、大青葉、白芍對金葡菌和鏈球菌有明顯的殺滅效果。魚腥草、枳殼對金葡菌和大腸桿菌有明顯的殺滅效果作用。

3 討論

從以上實驗數據可知，能夠抑制奶牛乳腺炎3種主要病原菌的中草藥有很多，其中，當歸、川芎、蒲公英、川紅花、白術、金銀花等有效殺滅引起奶牛乳腺炎的病原菌。說明應用中草藥治療奶牛乳腺炎有著很好的應用前景，而且為有效的中藥復方制劑研究奠定基礎[9]。

根據有關報道中草藥能夠有效抑制細菌的生長，其抗菌作用比抗生素強l000倍。但由于所使用的中草藥品質相差懸殊及復合方劑進入動物體內難以達到高效的體內抑菌濃度，使中草藥的治療效果欠佳。其中也與中草藥抗菌的有效活性成分在體內和體外的環境不同引起藥物抗菌能力下降有關，這也與動物體內消化液、酶、激素等化學成分對其影響較大有關，從而使很大部分中藥沒有達到與抗生素一樣的效果。另外，中藥不僅具有抗菌作用，還有抗炎作用和調節體內免疫的作用，因此，在選擇防治奶牛乳腺炎的中草藥時，不僅要進行體外抑菌試驗篩選，還要將挑選出來的中草藥進行動物體內抑菌試驗以確保藥物的安全、有效。

【參考文獻】

[1]魏彥.淺談中藥湯劑制法[J].中藥研究與信息，2002，4（7）：52-3.

[2]白峰，王文魁，王廣彬，等.22味中草藥對3種奶牛乳腺炎病原菌的體外抑菌試驗[J].畜牧獸醫雜志，2009（05）：5-7.

[3]馬保臣，李建基，劉翠艷.17種中藥對奶牛乳腺炎4種病原菌的抑菌試驗[J].中國獸醫雜志，2003（07）：28-9.

[4]丁月云，李茜，王恬.21種中藥對奶牛乳房炎3種病原菌的體外抑菌試驗[J].畜牧與獸醫，2004，（12）：5-7.

[5]王廣彬，劉耀偉，白峰，等.桉葉、艾葉對奶牛乳房炎主要病原菌的體外抑菌效果[J].廣西畜牧獸醫，2008（05）：296-7.

[6]李亞林，段曉琴，簡子健，等.中草藥對奶牛臨床型乳腺炎病原菌的體外抑菌試驗[J].畜禽業，2008（02）：58-60.

[7]徐叔云，卞如濂，陳修.藥理學實驗方法學[M].2002.

[8]郁建生，周芳英.20種中草藥制劑抑菌試驗初報[J].中獸醫學雜志，1995（1）：2-4.

[9]易湘蓉，李娜，劉毅，等.中草藥防治奶牛乳腺炎的研究綜述[J].上海畜牧獸醫通訊，2005（04）：2-4.

[責任編輯：曹明明]

1.2.4 結果判定標準

抑菌圈直徑Ф≥16mm為極度敏感；16mm≥Ф≥10mm為高度敏感；10mm≥Ф≥7mm小于為低敏感；7mm≥Ф為不敏感；無抑菌圈為耐藥[8]。

1.2.5 最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）測定

從體外抑菌試驗中選出11味對3種致病菌高度敏感的中藥采用試管法測定其MIC和MBC[4]。每種藥液用10支試管。試管中注入普通營養肉湯（用于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌）或血清營養肉湯（用于鏈球菌）lmL。將lmL滅菌藥液注入第l支試管，用移液槍吹打3下，混勻后吸取1ml注入第2支試管，倍比稀釋，依此類推，到第9管時吸出1mL棄掉，第10管不加藥液只加1mL純培養基。隨后分別在這10個試管中注入0.1mL菌液（含菌量為107/mL），吹打混和均勻。置37℃培養24h后觀察混濁度。從試管外觀察，透明、無混濁為此藥最小抑菌濃度（MIC）。從其中吸取10μL培養物接種于小牛血清瓊脂平板上，37℃培養36h計數菌落數。3個視野無菌落為無菌生長。此管中藥物的濃度為此藥的最小殺菌濃度。

2 結果

2.1 20味中藥體外抑菌試驗結果

從表1看出：川紅花、金銀花、白術、黃芩、茯苓、當歸、川芎對3種病原菌都有不同程度的抑菌作用；熟地、大青葉、白芍、地榆僅對金葡菌和鏈球菌有抑菌作用；枳殼僅對金葡菌和大腸桿菌有抑菌作用，對鏈球菌無抑菌作用。

2.2 11味中藥的MIC和MBC的測定結果

11種中藥的MIC和MBC的測定結果見表2。

由表2可以看出，當歸、川芎、蒲公英、川紅花、白術、金銀花對3種病原菌都有明顯的殺滅效果。熟地、大青葉、白芍對金葡菌和鏈球菌有明顯的殺滅效果。魚腥草、枳殼對金葡菌和大腸桿菌有明顯的殺滅效果作用。

3 討論

從以上實驗數據可知，能夠抑制奶牛乳腺炎3種主要病原菌的中草藥有很多，其中，當歸、川芎、蒲公英、川紅花、白術、金銀花等有效殺滅引起奶牛乳腺炎的病原菌。說明應用中草藥治療奶牛乳腺炎有著很好的應用前景，而且為有效的中藥復方制劑研究奠定基礎[9]。

根據有關報道中草藥能夠有效抑制細菌的生長，其抗菌作用比抗生素強l000倍。但由于所使用的中草藥品質相差懸殊及復合方劑進入動物體內難以達到高效的體內抑菌濃度，使中草藥的治療效果欠佳。其中也與中草藥抗菌的有效活性成分在體內和體外的環境不同引起藥物抗菌能力下降有關，這也與動物體內消化液、酶、激素等化學成分對其影響較大有關，從而使很大部分中藥沒有達到與抗生素一樣的效果。另外，中藥不僅具有抗菌作用，還有抗炎作用和調節體內免疫的作用，因此，在選擇防治奶牛乳腺炎的中草藥時，不僅要進行體外抑菌試驗篩選，還要將挑選出來的中草藥進行動物體內抑菌試驗以確保藥物的安全、有效。

【參考文獻】

[1]魏彥.淺談中藥湯劑制法[J].中藥研究與信息，2002，4（7）：52-3.

[2]白峰，王文魁，王廣彬，等.22味中草藥對3種奶牛乳腺炎病原菌的體外抑菌試驗[J].畜牧獸醫雜志，2009（05）：5-7.

[3]馬保臣，李建基，劉翠艷.17種中藥對奶牛乳腺炎4種病原菌的抑菌試驗[J].中國獸醫雜志，2003（07）：28-9.

[4]丁月云，李茜，王恬.21種中藥對奶牛乳房炎3種病原菌的體外抑菌試驗[J].畜牧與獸醫，2004，（12）：5-7.

[5]王廣彬，劉耀偉，白峰，等.桉葉、艾葉對奶牛乳房炎主要病原菌的體外抑菌效果[J].廣西畜牧獸醫，2008（05）：296-7.

[6]李亞林，段曉琴，簡子健，等.中草藥對奶牛臨床型乳腺炎病原菌的體外抑菌試驗[J].畜禽業，2008（02）：58-60.

[7]徐叔云，卞如濂，陳修.藥理學實驗方法學[M].2002.

[8]郁建生，周芳英.20種中草藥制劑抑菌試驗初報[J].中獸醫學雜志，1995（1）：2-4.

[9]易湘蓉，李娜，劉毅，等.中草藥防治奶牛乳腺炎的研究綜述[J].上海畜牧獸醫通訊，2005（04）：2-4.

[責任編輯：曹明明]

1.2.4 結果判定標準

抑菌圈直徑Ф≥16mm為極度敏感；16mm≥Ф≥10mm為高度敏感；10mm≥Ф≥7mm小于為低敏感；7mm≥Ф為不敏感；無抑菌圈為耐藥[8]。

1.2.5 最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）測定

從體外抑菌試驗中選出11味對3種致病菌高度敏感的中藥采用試管法測定其MIC和MBC[4]。每種藥液用10支試管。試管中注入普通營養肉湯（用于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌）或血清營養肉湯（用于鏈球菌）lmL。將lmL滅菌藥液注入第l支試管，用移液槍吹打3下，混勻后吸取1ml注入第2支試管，倍比稀釋，依此類推，到第9管時吸出1mL棄掉，第10管不加藥液只加1mL純培養基。隨后分別在這10個試管中注入0.1mL菌液（含菌量為107/mL），吹打混和均勻。置37℃培養24h后觀察混濁度。從試管外觀察，透明、無混濁為此藥最小抑菌濃度（MIC）。從其中吸取10μL培養物接種于小牛血清瓊脂平板上，37℃培養36h計數菌落數。3個視野無菌落為無菌生長。此管中藥物的濃度為此藥的最小殺菌濃度。

2 結果

2.1 20味中藥體外抑菌試驗結果

從表1看出：川紅花、金銀花、白術、黃芩、茯苓、當歸、川芎對3種病原菌都有不同程度的抑菌作用；熟地、大青葉、白芍、地榆僅對金葡菌和鏈球菌有抑菌作用；枳殼僅對金葡菌和大腸桿菌有抑菌作用，對鏈球菌無抑菌作用。

2.2 11味中藥的MIC和MBC的測定結果

11種中藥的MIC和MBC的測定結果見表2。

由表2可以看出，當歸、川芎、蒲公英、川紅花、白術、金銀花對3種病原菌都有明顯的殺滅效果。熟地、大青葉、白芍對金葡菌和鏈球菌有明顯的殺滅效果。魚腥草、枳殼對金葡菌和大腸桿菌有明顯的殺滅效果作用。

3 討論

從以上實驗數據可知，能夠抑制奶牛乳腺炎3種主要病原菌的中草藥有很多，其中，當歸、川芎、蒲公英、川紅花、白術、金銀花等有效殺滅引起奶牛乳腺炎的病原菌。說明應用中草藥治療奶牛乳腺炎有著很好的應用前景，而且為有效的中藥復方制劑研究奠定基礎[9]。

根據有關報道中草藥能夠有效抑制細菌的生長，其抗菌作用比抗生素強l000倍。但由于所使用的中草藥品質相差懸殊及復合方劑進入動物體內難以達到高效的體內抑菌濃度，使中草藥的治療效果欠佳。其中也與中草藥抗菌的有效活性成分在體內和體外的環境不同引起藥物抗菌能力下降有關，這也與動物體內消化液、酶、激素等化學成分對其影響較大有關，從而使很大部分中藥沒有達到與抗生素一樣的效果。另外，中藥不僅具有抗菌作用，還有抗炎作用和調節體內免疫的作用，因此，在選擇防治奶牛乳腺炎的中草藥時，不僅要進行體外抑菌試驗篩選，還要將挑選出來的中草藥進行動物體內抑菌試驗以確保藥物的安全、有效。

【參考文獻】

[1]魏彥.淺談中藥湯劑制法[J].中藥研究與信息，2002，4（7）：52-3.

[2]白峰，王文魁，王廣彬，等.22味中草藥對3種奶牛乳腺炎病原菌的體外抑菌試驗[J].畜牧獸醫雜志，2009（05）：5-7.

[3]馬保臣，李建基，劉翠艷.17種中藥對奶牛乳腺炎4種病原菌的抑菌試驗[J].中國獸醫雜志，2003（07）：28-9.

[4]丁月云，李茜，王恬.21種中藥對奶牛乳房炎3種病原菌的體外抑菌試驗[J].畜牧與獸醫，2004，（12）：5-7.

[5]王廣彬，劉耀偉，白峰，等.桉葉、艾葉對奶牛乳房炎主要病原菌的體外抑菌效果[J].廣西畜牧獸醫，2008（05）：296-7.

[6]李亞林，段曉琴，簡子健，等.中草藥對奶牛臨床型乳腺炎病原菌的體外抑菌試驗[J].畜禽業，2008（02）：58-60.

[7]徐叔云，卞如濂，陳修.藥理學實驗方法學[M].2002.

[8]郁建生，周芳英.20種中草藥制劑抑菌試驗初報[J].中獸醫學雜志，1995（1）：2-4.

[9]易湘蓉，李娜，劉毅，等.中草藥防治奶牛乳腺炎的研究綜述[J].上海畜牧獸醫通訊，2005（04）：2-4.

[責任編輯：曹明明]