左卡尼汀抑制過氧化氫介導的NFATc3核轉位*

戴紅良， 黃 雷， 賈桂枝， 梁春光， 李 昕， 戚春玲

(遼寧醫學院 1護理學院, 3生物化學與分子生物學教研室，遼寧 錦州 121001； 2錦州市食品藥品檢驗所，遼寧 錦州 121000)

左卡尼汀是位于線粒體膜的機體內源性化合物，主要來源于肝腎合成以及體外的飲食攝入[1-2]。其基本作用是促進長鏈脂肪酸轉運至線粒體進行β氧化，為機體供能[3]。除此之外，左卡尼汀還具有顯著的抗氧化活性[4-5]。我們之前的研究發現，左卡尼汀可顯著抑制過氧化氫(H2O2)誘導的心肌細胞凋亡，其抗凋亡機制與抑制Ca2+/鈣調神經磷酸酶(calcineurin, CaN)信號級聯有關[5-6]。胞漿活化T細胞核因子3(nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 3, NFATc3)是CaN下游的重要轉錄因子。本研究擬通過分析左卡尼汀對H2O2刺激下心肌細胞內NFATc3表達及分布的變化，進一步探討其抗氧化損傷的機制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1藥物與試劑 左卡尼汀、胰蛋白酶、DMEM低糖培養基T和Hoechst 33258染料均購于Sigma；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料研究所；細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒及BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術研究所；NFATc3及β-actin I抗購于Santa Cruz；Lamin B I抗購于Pierce；辣根過氧化物酶(horseradish peroxide, HRP)標記的II抗購于Santa Cruz;FITC標記的II抗購自北京中杉金橋公司。

1.2動物 出生1～3dSprague-Dawley(SD)大鼠乳鼠，雌雄不拘，由遼寧醫學院實驗動物中心提供。動物合格證號為SCXK(遼) 2003-0007。

2 方法

2.1心肌細胞培養 取出生1～3 d SD大鼠乳鼠，開胸取出心臟，用D-Hanks液沖洗3次后剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小的碎塊，在37 ℃條件下，以0.8 g/L胰蛋白酶消化分離細胞。將消化完畢的細胞以差速貼壁法進行純化后，置于含15%胎牛血清的DMEM培養液中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。待細胞融合后，換以含0.4%胎牛血清的DMEM，繼續培養24 h后，將細胞分組用于實驗。

2.2細胞核蛋白及漿蛋白提取 取處理完成的細胞，棄去培養基，PBS沖洗后用細胞刮子刮下細胞后，然后按照核蛋白提取試劑盒步驟提取核蛋白與漿蛋白。

2.3Westernblotting提取細胞蛋白后，BCA法測定蛋白濃度。取30μg總蛋白，以樣品緩沖液配平上樣體積，沸水煮5min后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，待電泳完成后電轉移至聚偏氟乙烯PVDF膜。用5%脫脂牛奶封閉1h，接著加NFATc3、β-actin及laminBI抗4 ℃孵育過夜。以含吐溫20的三羥甲基氨基甲烷緩沖液(Tris-bufferedsalinewithTween20,TBS-T)充分洗膜后，以HRP標記的II抗室溫孵育2h。TBS-T洗膜后，化學發光法顯色。 利用NIHImageJ1.42軟件對掃描的條帶進行灰度分析。

2.4細胞免疫熒光分析 取處理完成的細胞，以4%多聚甲醛固定30 min。加入0.2% Triton X-100作用30 min。以2%標準血清室溫封閉1 h。加入NFATc3 I抗于4 ℃孵育過夜。FITC標記的II抗室溫孵育1 h。用Hoechst 33258復染細胞核，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

3 統計學處理

采用SPSS 16.0統計軟件分析。數據以均數±標準差(mean±SD)表示。組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 左卡尼汀對H2O2刺激下心肌細胞內NFATc3表達的影響

結果顯示，H2O2、左卡尼汀及CaN特異性抑制劑環孢素A(cyclosporin A, CsA)均不影響NFATc3的表達,見圖1。

Figure 1. Effect of L-carnitine and CsA on NFATc3 expression in rat cardiac myocytes under H2O2 stimulation. Mean±SD.n=3.

2 左卡尼汀對H2O2刺激下胞漿及胞核中NFATc3表達的影響

與正常組比較，H2O2處理12 h后心肌細胞胞漿內NFATc3的表達顯著降低，而其在核內的表達則顯著增加，左卡尼汀及CsA本身并不影響NFATc3在胞漿及胞核的表達，但這2種藥物預處理均能顯著抑制H2O2誘導的上述改變，見圖2。

3 左卡尼汀對H2O2誘導的NFATc3核轉位的影響

免疫熒光的結果顯示， H2O2處理12 h顯著誘導NFATc3由胞漿到胞核的轉位；左卡尼汀及CsA本身不影響NFATc3的轉位，但這2種藥物均能阻止H2O2的促轉位作用，見圖3。

討 論

氧化應激是指細胞內氧化及抗氧化系統失衡，從而導致氧化作用過度激活的一種病理狀態。心肌受到損傷后，活性氧與自由基生成大大增加。已經證實，氧化應激在心肌缺血再灌注損傷、糖尿病性心肌病及心肌纖維化等病理過程中發揮著重要作用[7-9]。而應用抗氧化劑往往能夠取得良好效果[10]。

在正常的生理狀態下，Ca2+是細胞內重要的第二信使。而在病理狀態下，細胞內的Ca2+異常升高(Ca2+超載)則會對細胞帶來嚴重損傷。已有研究證實，活性氧/氮應激可以通過改變細胞內正常的Ca2+穩態過程，最終誘導細胞死亡[11]。在之前的研究中我們也發現，H2O2可誘發心肌細胞內的鈣超載，引起心肌凋亡。并發現左卡尼汀可通過抑制Ca2+下游CaN的過表達抑制心肌細胞凋亡[5]。

Figure 2. Effect of L-carnitine and CsA on NFATc3 expression in cytoplasmic and nuclear fractions. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs H2O2 group.

CaN是細胞內鈣離子執行功能的重要靶蛋白之一。CaN在H2O2誘導的心肌損傷中起著重要作用[5,12]。當CaN激活后，其可直接與轉錄因子NFATc3結合，使其發生去磷酸化，從而使其由胞質向胞核轉位。介導凋亡相關基因的表達[13]。許多物質可通過影響NFATc3的表達和(或)轉位發揮其生物學作用[14-15]。在本研究中，我們發現左卡尼汀雖然不能影響NFATc3的表達，卻可顯著抑制其自胞漿自胞核的轉位。另外，本研究還發現CaN特異性抑

Figure 3. Effect of L-carnitine and CsA on NFATc3 nuclear translocation in rat cardiac myocytes under H2O2 stimulation (×400).

制劑CsA可顯著抑制H2O2誘發的NFATc3核轉位。提示該現象是CaN依賴的。既然左卡尼汀可抑制CaN的表達[5]，那么左卡尼汀抑制NFATc3核轉位很可能是其抑制CaN表達的結果。

綜上所述，左卡尼汀對H2O2誘發的NFATc3的細胞核轉位呈現明顯的抑制作用。左卡尼汀發揮其抗氧化應激損傷可能與此有關。

[參 考 文 獻]

[1]Arrigoni-MartelliE,CasoV.Carnitineprotectsmitochondriaandremovestoxicacylsfromxenobiotics[J].DrugsExpClinRes, 2001, 27(1): 27-49.

[2] Lysiak W, Lilly K, DiLisa F, et al. Quantitation of the effect of L-carnitine on the levels of acid-soluble short-chain acyl-CoA and CoASH in rat heart and liver mitochondria[J]. J Biol Chem, 1988, 263(3): 1151-1156.

[3]ReboucheCJ,SeimH.Carnitinemetabolismanditsregulationinmicroorganismsandmammals[J].AnnuRevNutr, 1998, 18: 39-61.

[4] Chao HH, Liu JC, Hong HJ, et al. L-carnitine reduces doxorubicin-induced apoptosis through a prostacyclin-mediated pathway in neonatal rat cardiomyocytes[J]. Int J Cardiol, 2011, 146(2): 145-152.

[5] 賈桂枝,王洪新,李 紅, 等. 左卡尼汀調控鈣調神經磷酸酶表達抑制過氧化氫誘導心肌細胞凋亡作用[J]. 中國藥理學通報, 2014, 30(3): 425-428.

[6] 戴紅良,賈桂枝,劉 堃, 等. 左卡尼汀通過抑制鈣/鈣調素依賴蛋白激酶Ⅱ信號通路抑制過氧化氫誘導的大鼠心肌細胞凋亡[J].中國病理生理雜志, 2013, 29(7):1250-1254.

[7]ChouHC,ChanHL. 5-Methoxytryptophan-dependentprotectionofcardiomyocytesfromheartischemiareperfusioninjury[J].ArchBiochemBiophys, 2014, 543:15-22.

[8] Sun X, Chen RC, Yang ZH, et al. Taxifolin prevents diabetic cardiomyopathyinvivoandinvitroby inhibition of oxidative stress and cell apoptosis[J]. Food Chem Toxicol, 2014, 63:221-232.

[9]PurnomoY,PiccartY,CoenenT,etal.Oxidativestressandtransforminggrowthfactor-β1-inducedcardiacfibrosis[J].CardiovascHematolDisordDrugTargets, 2013, 13(2):165-172.

[10] Wang R, Miura T, Harada N, et al. Pleiotropic effects of the beta-adrenoceptor blocker carvedilol on calcium regulation during oxidative stress-induced apoptosis in cardiomyocytes[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2006, 318(1):45-52.

[11]ErmakG,DaviesKJ.Calciumandoxidativestress:fromcellsignalingtocelldeath[J].MolImmunol, 2002, 38(10):713-721.

[12] 馮 星, 金明華, 劉曉梅, 等. CaN抑制劑對H2O2誘導的大鼠H9c2心肌細胞凋亡的影響[J]. 吉林大學學報:醫學版, 2009, 35(2): 249-253.

[13]ZhuH,GaoW,JiangH,etal.CalcineurinmediatesacetylcholinesteraseexpressionduringcalciumionophoreA23187-inducedHeLacellapoptosis[J].BiochimBiophysActa, 2007, 1773(4): 593-602.

[14] Guo J, Gan XT, Haist JV, et al. Ginseng inhibits cardiomyocyte hypertrophy and heart failure via NHE-1 inhibition and attenuation of calcineurin activation[J]. Circ Heart Fail, 2011, 4(1):79-88.

[15]TanX,LiJ,WangX,etal.TanshinoneIIAprotectsagainstcardiachypertrophyviainhibitingcalcineurin/NFATc3pathway[J].IntJBiolSci, 2011, 7(3):383-389.