低劑量紫杉醇對膀胱出口部分梗阻后膀胱形態(tài)變化的影響*

王 博， 姜曉曉， 彭云鵬， 莊 巖， 孫曉青， 朱海濤

(徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科，江蘇 徐州 221002)

良性前列腺增生(benign prostate hyperplasia，BPH)是老年男性常見慢性疾病，長期梗阻引起膀胱形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，即便后期減輕或解除梗阻，患者的生存質(zhì)量仍難以提高[1]。目前認(rèn)為此種改變與膀胱出口梗阻(bladder outlet obstruction，BOO)后膀胱纖維化進(jìn)程密切相關(guān)。紫杉醇(paclitaxel，PTX)是傳統(tǒng)抗腫瘤藥物，近期研究發(fā)現(xiàn)小劑量使用紫杉醇可能有抗纖維化作用，已有其應(yīng)用于腸纖維化狹窄中的臨床報道[2]。本文通過建立大鼠BOO模型，觀察小劑量紫杉醇對膀胱出口部分梗阻后膀胱形態(tài)變化的影響。

材 料 和 方 法

1 動物

雌性Sprague-Dawley (SD) 大鼠30只，SPF級，6～8周齡，體重180～200 g，購自徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。于徐州醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

2 主要試劑與儀器

紫杉醇注射液購自湖北威爾曼制藥股份有限公司。Masson染色試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。石蠟切片機(jī)(Leica)和快速低溫恒溫器(Leica)由徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理教研室提供。中性甲醛和蘇木素、尼康顯微鏡照相系統(tǒng)(Nikon Eclipse 80i)由江蘇省腫瘤生物治療實(shí)驗(yàn)室提供。H-600透射電鏡來自Hitachi，超薄切片機(jī)來自LKB-V2088，由徐州醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物實(shí)驗(yàn)室提供。其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

3 主要方法

3.1動物分組和模型建立 雌性SD大鼠隨機(jī)分為3組：空白對照組10只、BOO組10只和紫杉醇組10只。BOO組與紫杉醇組用2%戊巴比妥鈉以30 mg/kg劑量腹腔麻醉后固定，消毒。將直徑1 mm硬膜外導(dǎo)管插入尿道至膀胱，取下腹部正中切口，逐層分離顯露近端尿道，以導(dǎo)管為支架，用3-0絲線結(jié)扎尿道，松緊度以能自由移動導(dǎo)管同時帶動周圍組織為標(biāo)準(zhǔn)，拔出導(dǎo)管，縫合下腹部切口。空白對照組只在相同部位做相同手術(shù)操作，但不結(jié)扎尿道。紫杉醇組在模型建立開始，給予紫杉醇溶于生理鹽水(0.3 mg/kg)后腹腔注射[3]，每周2次。空白對照組與BOO組以等體積生理鹽水同時間腹腔注射。同等條件飼養(yǎng)，自由飲食。4周后，稱量體重，取膀胱，去除周圍脂肪與結(jié)締組織，用濾紙吸凈水分,稱重。

3.2HE染色 膀胱組織于10%中性甲醛中固定24～48h后，依次給予乙醇梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟，包埋制成蠟塊，切片6μm，行HE染色，光鏡下觀察膀胱肌層的增生情況。

3.3Masson染色及評價 如上切片脫蠟水化，蘇木素10 min，流水沖洗5 min，復(fù)合染液染色5 min，沖去染液，磷鉬酸1 min，沖去后滴加亮綠染液染色10 s，水速洗，置于60 ℃溫箱中烘干，封片。用Image-Pro Plus 6.0軟件分析膠原纖維面積/(膠原纖維+逼尿肌的面積)比值。每張切片隨機(jī)統(tǒng)計5個視野后取平均值，以此比值來反應(yīng)纖維化的程度。

3.4超微結(jié)構(gòu)觀察 膀胱離體后立即取體部組織，切成1mm×1mm×1mm大小，2.5%戊二醛中4 ℃固定2h，0.1mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗3遍，1%鋨酸溶液固定2h，雙蒸水洗3遍，依次放入梯度乙醇、90%-無水丙酮脫水，樹脂：丙酮(1∶2)室溫下浸泡2h，樹脂：丙酮(2∶1)室溫下浸泡2h，純樹脂室溫下浸透2h，環(huán)氧樹脂(Epon812)包埋聚合后修整包埋塊，超薄切片機(jī)制作超薄切片，醋酸鈾及檸檬酸鉛雙染色，H-600型透射電鏡下觀察、照相。鏡下主要觀察逼尿肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞細(xì)胞器及細(xì)胞間連接的改變。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，多重比較使用S-N-K法,方差不齊時采用Dennett’s方法作多重比較。應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠終末體重、膀胱重量及大體形態(tài)的觀察

各組大鼠體重?zé)o明顯差異[(217.00±10.46) g, (210.43±20.91) g, (212.63±11.89) g，P>0.05], 而在膀胱重量方面，BOO組[(0.376±0.052)g]明顯高于空白對照組[(0.112±0.014)g，P<0.05]，紫杉醇組[(0.215±0.025)g]低于BOO組(P<0.05)。BOO組膀胱重量與體重比值[(0.180±0.025)%]高于空白對照組[(0.052±0.006)%，P<0.05]，而紫杉醇組[(0.101±0.013)%]低于BOO組(P<0.05)。

標(biāo)本大體觀察：BOO組膀胱中多出現(xiàn)大量渾濁尿液，抽取尿液后多殘留有泥沙樣細(xì)小結(jié)石，膀胱內(nèi)壁出現(xiàn)明顯小梁突向腔內(nèi)，厚度較空白對照組膀胱明顯增加。紫杉醇組膀胱內(nèi)尿液顏色較清，較少發(fā)現(xiàn)結(jié)石，膀胱內(nèi)壁略光滑，整體膀胱厚度較BOO組減小。

2 膀胱組織的HE染色觀察

空白對照組逼尿肌肌束排列整齊，肌束間隙中被結(jié)締組織所充滿，胞漿均勻、胞核清晰。BOO組逼尿肌肌束肥大，肌細(xì)胞數(shù)量增多排列紊亂，肌束間隙減小。相比BOO組，紫杉醇組中平滑肌增生較弱，數(shù)量略少，肌束間隙略大，見圖1。

Figure 1. Pathological changes of bladder tissues with HE staining (×400).

3 膀胱組織的Masson染色觀察

膠原纖維為藍(lán)染，主要位于黏膜下層與肌束之間，肌組織成紅色。與空白對照組相比，BOO組表現(xiàn)為逼尿肌增生及膠原纖維數(shù)量均增加。紫杉醇組中逼尿肌細(xì)胞略增生，但膠原纖維與BOO組比顯著減少，見圖2。

Figure 2. Pathological changes of bladder tissues with Masson staining (×400).

各組平均膠原纖維所占面積比值分別為38.94%±3.67%、29.66%±2.69%和19.94%±1.90%。與空白對照組相比，BOO組膠原纖維面積比值顯著下降(P<0.05);與BOO組相比，紫杉醇組膠原纖維面積比值顯著下降(P<0.05)，見圖3。

4 超微結(jié)構(gòu)的改變

電鏡下可見空白對照組肌細(xì)胞間間隙狹窄，間隙兩側(cè)可見有高電子密度物質(zhì)堆積，即肌細(xì)胞通過典型的中間連接與鄰近的細(xì)胞相連。質(zhì)膜下，小泡與密斑較多。胞質(zhì)內(nèi)見少量線粒體，線粒體完整，形態(tài)與比例正常。胞核為橢圓形，染色質(zhì)分布均勻。

BOO組中可見平滑肌外形較為肥大并且扭曲變形，肌間隙增寬，中有大量的膠原纖維蛋白，并且發(fā)現(xiàn)有部分類似胞漿細(xì)胞器損傷碎片脫落于間隙。細(xì)胞之間中間連接明顯減少，出現(xiàn)大量突起交錯，形成豐富的突觸連接與橋粒連接。肌質(zhì)膜下小泡與密斑缺乏。胞漿肌絲增多，顏色較深并且走形紊亂。胞質(zhì)內(nèi)線粒體豐富，出現(xiàn)水腫，內(nèi)脊減少。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多，功能旺盛，胞質(zhì)內(nèi)同時出現(xiàn)空泡樣變及脫顆粒現(xiàn)象。胞核大，分裂多見，染色質(zhì)邊集，部分出現(xiàn)核周水腫。間質(zhì)中成纖維細(xì)胞中線粒體數(shù)量增加，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多擴(kuò)張，核皺褶增多，功能旺盛。

Figure 3. The percentage of the collagen area [collagen/(collagen+muscle)] in the rats with different treatments. Mean±SD. n=8.*P<0.05 vs sham group; #P<0.05 vs BOO group.

紫杉醇組中平滑肌外形略肥大，相比空白對照組肌間隙增寬，細(xì)胞之間中間連接略減少，出現(xiàn)略多量突觸連接與橋粒連接。胞質(zhì)內(nèi)線粒體略擴(kuò)張，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)略增多。核膜增厚，染色質(zhì)略紊亂，見圖4、5。

Figure 4. Electron micrographs of fibroblasts and collagen fibers between detrusor smooth muscle cells. The examples of collagen deposition were highlighted with the arrows (→). Slight collagen fibers were observed in sham group, a great quantity of collagen fibers existed in the interstitium in BOO group, and the intercellular space contained less collagen fibers in low-dose paclitaxel group than that in BOO group. Scale bar=500 nm.

Figure 5. Electron micrographs of intercellular junction between detrusor smooth muscle cells. Scale bar=500 nm.

討 論

BPH是一種慢性的、復(fù)雜的疾病, 雖然BPH是良性增生,但它會導(dǎo)致持續(xù)的尿路梗阻和下尿路刺激癥狀[4]，往往消極影響健康和生活質(zhì)量。目前多針對病因行藥物或手術(shù)治療[5]，但在梗阻的后期即使消除梗阻仍然會有部分患者難以恢復(fù)正常的膀胱功能。以上這些癥狀的表現(xiàn)與膀胱形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化是密切相關(guān)的。Metcalfe等[6]的報道指出，BOO后膀胱的形態(tài)變化經(jīng)歷炎癥滲出、逼尿肌增生和終末膀胱纖維化的過程，與此同時膀胱功能的變化也由代償轉(zhuǎn)向失功能的失代償狀態(tài)。

本實(shí)驗(yàn)中梗阻后膀胱重量顯著增加，光鏡下可見明顯增生的肌細(xì)胞，黏膜下與肌束間膠原纖維增多，這些變化與Kitajima等[7]觀察是相符的。BOO組纖維面積/(膠原纖維+肌肉面積)的值相比空白對照組的值要低，提示此時期肌細(xì)胞增生比膠原纖維迅速[8]。

對超微結(jié)構(gòu)形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，BOO后肌細(xì)胞間中間連接明顯減少，出現(xiàn)豐富的突觸與橋粒連接。周逢海等[9]報道細(xì)胞連接方式從協(xié)同的機(jī)械偶聯(lián)轉(zhuǎn)變成局限傳播的電偶聯(lián)，此可能是引發(fā)膀胱不穩(wěn)定收縮(DI)的重要原因。同時肌間隙出現(xiàn)大量膠原纖維，楊進(jìn)益等[10]認(rèn)為其富有的伸展特性使得膀胱的順應(yīng)性提高，韌性增加，考慮此是BPH患者出現(xiàn)慢性尿潴留的基礎(chǔ)，而后期膠原纖維過量增多則引起膀胱順應(yīng)性下降[11]，最終引起膀胱纖維化。由此可見膠原纖維過度沉積是引發(fā)膀胱功能損害的主要因素[12]。因此早期控制膠原沉積、抑制纖維化進(jìn)程是保護(hù)BOO后膀胱功能的重要前提。

紫杉醇是來源于太平洋紫杉樹的樹皮提取物，是一種通過穩(wěn)定微管形態(tài)調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝活動的抗腫瘤藥物。近期研究發(fā)現(xiàn)小劑量紫杉醇可能在多種非癌疾病方面有治療作用,如皮膚紊亂性疾病、腎肝纖維化、抑制炎癥、保護(hù)缺血損傷和預(yù)防冠狀動脈再狹窄等[13-14]。在膠原沉積引發(fā)疾病研究中，低劑量紫杉醇多有抑制纖維化進(jìn)程的作用。

瘢痕形成中[15]，局部涂抹紫杉醇能降低大鼠損傷氣道組織中成纖維細(xì)胞及炎癥細(xì)胞數(shù)量，抑制瘢痕形成。在大鼠肺纖維化模型中發(fā)現(xiàn)[16]，注射低劑量紫杉醇(0.6 mg/kg)能降低肺濕重與體重比例，減輕肺纖維化程度，相應(yīng)細(xì)胞水平研究中Sandbo等[17]發(fā)現(xiàn)，紫杉醇抑制肺纖維化可能通過調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子β1介導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞分化實(shí)現(xiàn)。在大鼠單側(cè)輸尿管梗阻研究中[3]，腹腔注射低劑量紫杉醇(0.3 mg/kg，每周2次)能夠降低膠原和纖聯(lián)蛋白的表達(dá)，降低腎小管間質(zhì)性纖維化程度。類似的情況還在大鼠肝纖維化、全身系統(tǒng)性硬化等不同領(lǐng)域不同器官的纖維化中有相關(guān)的報道。由此可以推測紫杉醇很有可能是治療由膠原沉積引發(fā)疾病的有用藥物。雖然低劑量紫杉醇在多種器官中有報道，但在膀胱纖維化進(jìn)程中還未見此方面的相關(guān)研究。

本實(shí)驗(yàn)中，與BOO組相比，紫杉醇干預(yù)后膀胱重量顯著降低，光鏡下可見肌細(xì)胞體積略小，平滑肌增生減弱，在黏膜下與肌束間膠原纖維減少，并且膠原纖維面積/(膠原纖維+肌肉面積)比值要低于BOO組，提示紫杉醇可能對BOO后膠原纖維沉積有改善作用。在超微結(jié)構(gòu)方面，紫杉醇組肌間隙減小，細(xì)胞之間出現(xiàn)略多量突觸連接與橋粒連接，仍以中間連接為多見，肌細(xì)胞間隙內(nèi)膠原纖維量減少，提示紫杉醇有可能通過形態(tài)方面影響對膀胱功能起到一定程度的保護(hù)作用。

綜上所述，BOO后膀胱出現(xiàn)逼尿肌增生、膠原纖維沉積、細(xì)胞連接方式改變等形態(tài)變化，使用低劑量紫杉醇后對BOO膀胱形態(tài)改變有一定程度的改善作用，這可能是通過調(diào)控細(xì)胞增生、抑制纖維合成等方式實(shí)現(xiàn)的。這將為我們研究BOO后膀胱損傷的發(fā)展并保護(hù)膀胱正常功能提供重要線索。另外，本實(shí)驗(yàn)只是從形態(tài)學(xué)上初步探索低劑量紫杉醇對BOO后膀胱變化的影響，其內(nèi)在具體分子機(jī)制以及紫杉醇使用的劑量效應(yīng)關(guān)系還需進(jìn)一步研究獲得。

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