環孢菌素D衍生物PSC833逆轉K562/DOX細胞的凋亡抗性及其機制

劉 玲， 王建剛， 李 艷， 王淑英

(河南科技大學醫學院藥學系，河南 洛陽 471003)

多藥耐藥性(multidrug resistance, MDR)是腫瘤化療失敗的重要原因，P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的高表達是腫瘤MDR的重要機制之一。P-gp為mdr1a基因的產物，由1 280個氨基酸組成，分子量170～180 kD，屬于能量依賴性藥物外排泵，可將抗癌藥物由腫瘤細胞內外排至細胞外，使腫瘤細胞內藥量減少，引起MDR的產生[1]。P-gp逆轉劑都是P-gp底物，可競爭性或非競爭性抑制P-gp的外排功能，從而增加腫瘤細胞內藥物蓄積，達到逆轉腫瘤耐藥的目的。PSC833是環孢菌素D的衍生物，具有非常強的P-gp逆轉作用，同時沒有環孢菌素A(cyclosporine A， CsA)的免疫抑制作用，是近年來發現的一種較好的P-gp抑制劑，也是目前唯一的進行臨床研究的P-gp逆轉劑。體外試驗研究表明，PSC833對P-gp的抑制作用是CsA的10～20倍，對P-gp的結合力也比CsA高，因而不易被P-gp泵出到細胞外[2]。本實驗擬觀察環孢菌素D衍生物PSC833能否逆轉人白血病細胞耐藥株K562/DOX的抗凋亡作用，以及與凋亡調控蛋白表達的關系，深入探討其逆轉多藥耐藥的分子機制。

材 料 和 方 法

1 材料與細胞培養

PSC833由中國藥科大學何玲教授提供；RPMI-1640培養基和胎牛血清(Gibco)；MTT (Sigma)；Annexin V/PI雙染試劑盒(BD)；鹽酸阿霉素(浙江海正藥業股份有限公司)、硫酸長春新堿(上海華聯制藥有限公司)；活性氧(DCFH-DA)檢測試劑盒和線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)、Fluo-3/AM、細胞裂解液、BCA蛋白含量檢測試劑盒、線粒體分離試劑盒(碧云天生物技術研究所)；細胞周期測定試劑盒、ECL檢測試劑盒(南京凱基生物技術有限公司)；細胞色素 C(cytochrome C, Cyt C)、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、β-actin抗體和anti-rabbit IgG購于Bioworld。其余試劑均為市售分析純。

人白血病細胞系K562及其耐藥細胞系K562/DOX(耐阿霉素)、人臍靜脈血管內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)由本室保存和提供。K562/DOX、K562和HUVECs用含10%小牛血清的RPMI-1640 培養基在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的條件下培養，在K562/DOX細胞培養基中加入0.5 μmol/L阿霉素，實驗前14 d更換無阿霉素的培養基后繼續培養。

2 方法

2.1MTT法測定PSC833的耐藥逆轉實驗 收集對數生長期K562/DOX和K562細胞，以5×104cells/well的密度接種于96孔板，24 h后加入不同濃度的DOX/VCR，檢測在有或無PSC833存在條件下，DOX/VCR對細胞的毒性。PSC833終濃度為1、 2.5、 5和10 μmol/L。空白對照組加入等體積的PBS。每一濃度設4個平行孔。待細胞與藥物作用44 h后，每孔加入5 g/L MTT，繼續培養4 h，加入細胞裂解液，靜置過夜使細胞裂解結晶全部溶出，用酶標儀在570 nm處測定吸光度(A)，按以下公式計算抑制率，并求出半數抑制率(IC50)和逆轉倍數(reversal fold, RF)。抑制率(%)=(1-實驗組A/空白對照組A)×100%；RF= IC50(單用細胞毒藥物)/ IC50(細胞毒藥物+P-gp逆轉劑)。

同時，采用MTT法檢測PSC833對HUVECs的毒性作用，方法同上。

2.2PI染色檢測細胞周期 將對數生長期的細胞消化接種到培養瓶中，次日，待細胞貼壁后，根據組別設置加入相應的含藥培養基，同時設立陰性對照組、PSC833單用組(10 μmol/L)、DOX單用組(10 μmol/L)、DOX(10 μmol/L)和PSC833(2.5 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L)合用組；藥物作用24 h后，用0.25%胰酶(不含EDTA)消化收集細胞；用PBS洗滌細胞2次(2 000 r/min 離心5 min)，收集并調整細胞濃度為1×109/L；制備的單細胞懸液用體積分數為70%乙醇固定2 h，4 ℃保存，染色前用PBS洗去固定液；加100 μL RNase A 37 ℃水浴30 min；再加入400 μL PI染色混勻，4 ℃避光30 min；上機檢測，記錄激發波長488 nm 處紅色熒光。

2.3AnnexinV/PI雙染流式細胞術檢測細胞凋亡 取對數生長期的K562/DOX細胞接種于6孔板中，分組同上，經PSC833 2.5、5和10μmol/L作用24h后，將收集的細胞用冷PBS洗2次，緩沖液(bindingbuffer)用三蒸水稀釋10倍，用緩沖液配成1×109/L的細胞濃度；吸取100μL至試管中，加入AnnexinV試劑和PI各5μL，混勻避光孵育15min；加入400μL染色緩沖液，混勻，流式細胞術檢測。

2.4流式細胞術檢測線粒體膜電位、活性氧水平和細胞內鈣 取處于對數生長期狀態良好的細胞，消化后接種于6孔板中，培養24 h，分組同上。換用含3%血清的RPMI-1640培養基，加入藥物繼續培養24 h。收集細胞，PBS洗滌2次，離心，棄上清，重懸于0.5 mL含3%血清的RPMI-1640培養基中。加入0.5 mL JC-1染色工作液，顛倒數次混勻。細胞培養箱中37 ℃孵育20 min。孵育結束后，600×g4 ℃離心3～4 min，棄上清，用JC-1染色緩沖液洗滌2次后，用適量JC-1染色緩沖液重懸后，用流式細胞術分析。

藥物作用24 h后，細胞處理同上。按照1∶1 000用無血清培養液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/L。加入適當體積稀釋好的DCFH-DA。37 ℃細胞培養箱內孵育20 min。用無血清細胞培養液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。用流式細胞術檢測細胞的平均熒光強度。

藥物作用24 h后，細胞處理同上。換用含3%血清的RPMI-1640培養基，加入藥物繼續培養24 h。收集細胞，PBS洗滌2次，離心，棄上清。加入5 μmol/L Fluo-3/AM，37 ℃孵育30 min，再次洗滌后，用流式細胞術分析。

2.5Westernblotting檢測蛋白表達 加藥處理細胞24h后，收集細胞并用裂解液裂解細胞獲得總蛋白。采用BCA試劑盒于562nm處測定樣品蛋白含量。然后，采用12%SDS-PAGE分離總蛋白，蛋白質轉移到PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2h。封閉過的膜用TBST洗滌3次。將膜放入雜交袋中，加入Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，使抗原抗體充分結合。隔天，將膜從雜交袋中取出，用TBST洗滌3次；再放入新雜交袋中，加入Ⅱ抗以結合Ⅰ抗，室溫孵育膜2h。化學發光法檢測，用凝膠成像系統拍照成像。目的蛋白的灰度值除以內參照β-actin的灰度值以校正誤差，所得結果代表某樣品的目的蛋白相對含量。

3 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，用SPSS 13.0軟件分析，組間均數的比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 PSC833對K562/DOX細胞耐藥的逆轉作用

K562/DOX細胞對DOX和VCR的耐藥倍數分別為52.44和564倍；PSC833與DOX/VCR合用后，IC50呈劑量依賴性減少，而RF呈劑量依賴性增加；對K562細胞，則不改變其IC50值，各組間差異無統計學意義，見表1、2。

表1 PSC833對K562/DOX細胞DOX的耐藥逆轉作用

*P<0.05,**P<0.01vsDOX.

表2 PSC833對K562和K562/DOX細胞VCR的耐藥逆轉作用

**P<0.01vsVCR.

PSC833在50 μmol/L以下時對HUVECs細胞的生長沒有顯著影響，細胞存活率在90%以上，見圖1。

2 PSC833對DOX阻滯細胞周期的影響

與對照組相比，PSC833單用組和DOX單用組對細胞周期影響較小。而PSC833合用DOX可劑量依賴性增加G2/M期細胞的比例，減少G0/G1期細胞的比例，使細胞周期阻滯于G2/M期，對S期細胞的比例無明顯改變，表明PSC833的耐藥逆轉作用與阻滯細胞周期G2/M期有關，見圖2。

Figure 1. The effect of PSC833 on HUVEC growth.Mean±SD.n=3.

Figure 2. The effect of PSC833 on DOX-induced cell cycle progression in K562/DOX cells.

3 PSC833對DOX誘導線粒體膜電位的影響

與對照組相比，PSC833單用組和DOX單用組對線粒體膜電位影響較小。與DOX單用相比，PSC833和DOX合用后引起線粒體膜電位下降，Q4區比率明顯增加，表明線粒體膜電位降低幅度加大，達到85.9%,見圖3。

4 PSC833對DOX引起的活性氧水平的影響

與對照組相比，PSC833單用組和DOX單用組對活性氧水平影響較小。與DOX單用組相比，PSC833和DOX合用后可引起活性氧水平顯著增加，見圖4。

5 PSC833對DOX引起的細胞內鈣的影響

PSC833和DOX合用后，K562/DOX細胞內的熒光強度明顯升高，[Ca2+]i增加；單用PSC833和單用DOX細胞內[Ca2+]i均未見顯著變化，見圖5。

6 PSC833對DOX誘導的K562/DOX細胞凋亡的影響

與對照組相比，PSC833單用時對K562/DOX細胞凋亡率影響較小，DOX單用時對K562/DOX細胞凋亡率僅8.25%。隨著PSC833濃度的增加，早期凋亡細胞、晚期凋亡和壞死細胞數量顯著增加，且作用呈劑量依賴性，見圖6。

7 PSC833對阿霉素誘導的K562/DOX細胞凋亡相關蛋白的影響

與對照組相比，PSC833和DOX單用時對凋亡蛋白Cyt C、Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3表達影響較小；PSC833和DOX作用24 h后，線粒體中的Cyt C表達減少，而胞漿中Cyt C的表達水平相應增加；Bcl-2下調，Bax上調，caspase-3前體剪切形成活化的cleaved caspase-3，并且cleaved caspase-3的表達量隨著PSC833的濃度增加而升高，誘導K562/DOX耐藥細胞凋亡,見圖7。

Figure 3. The effect of PSC833 on DOX-induced mitochondrial membrane potential in K562/DOX cells.Mean±SD.n=3.** P<0.01 vs DOX.

Figure 4. The effect of PSC833 on DOX-induced intracellular ROS production in K562/DOX cells. Mean±SD.n=3.** P<0.01 vs DOX.

Figure 5. The effect of PSC833 on DOX-induced intracellular calcium fluorescent intensity in K562/DOX cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05, ** P<0.01 vs DOX.

討 論

關于MDR產生的機理目前還不特別明確，但大多數具MDR的細胞膜表面都有P-gp的過度表達。K562/DOX耐藥細胞系是由K562細胞經過長期的阿霉素誘導和篩選而建立起來的典型的耐藥細胞系，mdr1 mRNA及P-gp高表達，不僅對誘導藥物阿霉素有很強的耐藥性，而且對抗腫瘤藥物也具有交叉耐藥性。PSC833作為多藥耐藥逆轉劑，能增強MDR細胞系對其它化療藥物如阿霉素、紫杉醇等的敏感性。研究發現，PSC833可增加耐阿霉素的肺癌細胞株(SK-MES-1/DX1000)對阿霉素的敏感性，降低P-gp底物Rh123在細胞內的累積，下調MDR1 mRNA和P-gp的表達，激活JNK/c-Jun/AP-1通路和抑制NF-κB的表達，從而逆轉耐藥細胞株(SK-MES-1/DX1000)對阿霉素的耐藥性[3]。

腫瘤的多藥耐藥性與抗凋亡作用關系密切。研究發現，阿霉素可激活細胞內酸性鞘磷脂酶，導致神經酰胺形成，最終激活caspase-3而引起細胞凋亡，caspases的活化及其所引發的細胞毒作用也需要酸性的細胞內環境[4]。作為抗凋亡分子，P-gp可跨膜轉運內源性鞘磷脂，通過減少質膜上的鞘磷脂使神經酰胺生成減少，阻止凋亡的發生；P-gp還可通過增加細胞內pH, 降低細胞內游離藥物濃度，并使caspases處于失活狀態，從而抑制caspases依賴性的細胞凋亡[5]。線粒體膜電位的喪失是線粒體凋亡途徑的先決條件。當線粒體內活性氧大量產生，線粒體膜通透性改變，導致線粒體膜勢能發生改變，進而引起線粒體釋放Cyt C及細胞凋亡起始因子(apoptosis initiating factors, AIFs)等，這樣可以激活caspases，從而誘導細胞凋亡的發生[6]。另外，線粒體外膜通透性的改變也可直接由Bcl-2家族蛋白控制。Ca2+作為第二信使觸發或者調控多種細胞內事件而使細胞執行一系列特定的功能。鈣離子不僅參與細胞凋亡早期Cyt C的釋放和caspase-3的激活，而且也作用于凋亡晚期的DNA裂解[7]。

研究發現，PSC833能顯著抑制P-gp的外排功能，增加耐藥細胞對其它藥物的敏感性，逆轉細胞的多藥耐藥性[8-9]。但PSC833在DOX誘導細胞凋亡過程中所致的活性氧與線粒體膜電位的改變均未見報道。因此，我們進一步觀察了PSC833對K562/DOX細胞阿霉素、長春新堿耐藥的逆轉作用，及其對K562/DOX細胞凋亡和相關蛋白表達的影響。結果顯示，PSC833可劑量相關性地逆轉K562/DOX細胞對DOX/VCR的耐藥、明顯增加DOX誘導的K562/DOX細胞凋亡。本研究利用熒光探針DCFH-DA檢測到PSC833和DOX處理后，K562/DOX細胞活性氧明顯增加，說明PSC833誘導細胞凋亡的過程中活性氧的改變起到了重要的作用。活性氧的改變可導致線粒體膜電位的改變，因此我們利用JC-1熒光探針，用流式細胞術檢測細胞線粒體膜電位水平，發現耐藥細胞由Q2向Q4象限移動(膜電位降低)，呈一定的劑量依賴性，證實PSC833和DOX合用可降低線粒體膜電位，由此推測PSC833的耐藥逆轉作用可能是通過線粒體通路誘導細胞凋亡發揮抗腫瘤作用的。[Ca2+]i的升高被認為是凋亡的啟動環節。結果顯示，K562/DOX細胞內的熒光強度明顯升高，[Ca2+]i顯著增加，因此Ca2+作為第二信使也參與了凋亡過程。線粒體外膜的損傷可以導致Cyt C釋放，與Apaf-1結合后，形成一個多聚體即凋亡體，凋亡體募集pro-caspase-9，使其自我激活。Caspase-9前體聚合后被反式催化激活，活化的caspase-9繼而激活下游執行caspases(caspase-3、-6、-7)，切割許多重要底物，導致凋亡的發生。本研究發現PSC833和DOX合用后，線粒體中Cyt C表達降低而胞漿中表達升高，提示凋亡線粒體通路的激活；同時，抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調，促凋亡蛋白Bax表達上調，激活cleaved caspase-3而啟動了級聯反應，誘導細胞凋亡。PSC833對K562/DOX細胞耐藥逆轉作用可能是PSC833抑制P-gp的外排作用，使細胞內DOX濃度增加，增強了DOX的凋亡誘導作用；另一方面，可能降低了P-gp對細胞凋亡的抑制作用，使K562/DOX細胞更易發生凋亡，從而介導活性氧升高，導致細胞線粒體膜電位的降低、[Ca2+]i顯著增加，釋放Cyt C，激活caspase-3，導致細胞凋亡。

Figure 6. The effect of PSC833 on DOX-induced apoptosis in K562/DOX cells.Mean±SD.n=3. **P<0.01 vs DOX.

Figure 7. The effect of PSC833 on DOX-induced expression of Cyt C, Bcl-2, Bax and cleaved caspase-3 proteins.1: control; 2: DOX (10 μmol/L); 3: PSC833 (10 μmol/L); 4: PSC833 (2.5 μmol/L)+DOX; 5: PSC833 (5 μmol/L)+DOX; 6: PSC833 (10 μmol/L)+DOX.Mean±SD.n=3.** P<0.01 vs 2.

[參 考 文 獻]

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