低氧誘導的小窩蛋白-1上調參與人肺腺癌細胞A549遷移和侵襲*

左 蓓, 刑 敏， 孫珍貴， 汪向海， 陳興無

(皖南醫學院弋磯山醫院呼吸內科，安徽 蕪湖 241001)

惡性胸腔積液(malignantpleuralefusion，MPE)最常見病因為肺癌，其是非小細胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)患者預后不良的標志，目前尚無根治方法。癌細胞胸膜轉移是MPE形成的主要原因，而轉移的初始步驟是癌細胞遷移和侵襲。腫瘤微環境信號分子對癌細胞的遷移特性產生重要影響，MPE內富含多種細胞因子、趨化因子和生長因子等復雜成分，對維持癌細胞的生長、遷移和侵襲有十分重要的意義。

小窩蛋白-1(caveolin-1,Cav-1)是細胞質膜微囊主要結構蛋白，通過調節細胞生長分化和增殖侵襲而與腫瘤的發生發展密切相關。Davidson等[1]觀察卵巢癌及原發性腹膜癌并發胸腹腔積液中癌細胞及腫瘤原發灶Cav-1的表達，發現胸腹水中癌細胞無論細胞膜還是細胞質Cav-1表達陽性率明顯高于腫瘤原發灶中癌細胞相應部位Cav-1陽性率。肺癌組織中Cav-1表達下降，表現為抑癌作用。但在不同分期的肺癌，其表達存在差異。免疫組化分析NSCLC患者術后癌組織，發現幾乎所有無淋巴結轉移的標本Cav-1表達量很少，而在局部淋巴結轉移的標本，Cav-1表達顯著增加，提示Cav-1可能促進NSCLC細胞淋巴結轉移[2]。目前認為肺癌患者Cav-1表達水平與轉移能力增強和短生存期有關[3]。但胰腺癌和乳腺癌Cav-1過表達則抑制癌細胞的運動[4]。因此，Cav-1在癌細胞遷移和轉移包括漿膜腔轉移中的作用及其生成調節仍不清楚，可能呈細胞依賴性。最近研究發現Cav-1在腫瘤組織中的表達與腫瘤缺氧微環境密切相關，Cav-1可能作為缺氧誘導因子(hypoxia-induciblefactor,HIF)-1α的下游基因在腫瘤的發生發展中起著重要的作用[5]。

我們推測Cav-1在MPE中表達升高參與MPE發生，其生成可能與低氧環境誘導的HIF-1α生成有關。本研究比較肺癌及結核性胸膜炎患者胸腔積液中Cav-1和HIF-1α表達水平及兩者相關性并以不同濃度二氯化鈷(CoCl2)作用于肺腺癌A549細胞誘導細胞缺氧，探討低氧誘導生成的Cav-1對A549細胞遷移和侵襲的影響及HIF-1α對Cav-1生成的調節。

材 料 和 方 法

1 臨床病例資料

選擇皖南醫學院弋磯山醫院呼吸內科2011年7月～2012年7月間確診為肺癌合并胸水的住院患者(MPE組)52例(男38例，女14例)，平均年齡(62.33±11.91)歲、結核性胸水患者(TBPE組)25例(男17例、女8例)，平均年齡(38.54±16.14)歲，所有患者簽知情同意書。MPE診斷標準：(1) 患者影像學符合原發性支氣管肺癌合并胸腔積液；(2) 胸腔積液中找到肺癌細胞和(或)胸膜活檢標本病理學確診為肺癌；TBPE診斷標準：胸水為滲出液，腺苷脫氨酶(adenosine deaminase, ADA)>40 IU/L，胸膜活檢示結核性肉芽腫[6]。

2 胸水采集和存儲

收集患者入院后第1次經胸腔穿刺抽取的胸水20 mL，經3 000 r/min離心分離，留取上清等份分裝于離心管、-20 ℃凍存備用。

3 A549細胞的培養與處理

人肺腺癌細胞株A549細胞(中科院細胞庫)常規培養于含10%胎牛血清(杭州四季清公司)的RPMI-1640培養基中，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。以不同濃度的CoCl2(0、100、200、400、800 μmol/L，Sigma)作用A549細胞24 h；在另一實驗中，以200 μmol/L CoCl2作用細胞6、12、24、48 h。為觀察HIF-1α對Cav-1生成的影響，以200 μmol/L CoCl2作用A549細胞(培養液含0.1% DMSO)或同時加入HIF-1α抑制劑YC-1(10或100 μmol/L，Sigma)培養細胞24 h,培養結束后取細胞上清，3 000 r/min離心，留取上清-20 ℃保存。

4 主要方法

4.1MTT檢測CoCl2對肺腺癌A549細胞存活及生長狀態的影響 取對數生長期細胞，將A549細胞以1×108/L接種于96孔板；細胞貼壁后加入含不同濃度CoCl2(0、100、200、400、800 μmol/L)的無血清培養液培養12、24、48 h，每組設6復孔；每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L，Sigma)，繼續培養4 h；加入150 μL DMSO，于全自動酶標儀549 nm處測定吸光度值(A)。根據A值繪制細胞生長曲線，并計算細胞生長抑制率(IR)。IR=[1-(A實驗孔值/A陰性對照孔值)]×100%，實驗重復3次，取平均值。

4.2細胞劃痕實驗 將A549細胞以1×108/L的密度接種于24孔培養板，待細胞完全融合后，無血清培養液繼續培養24h。用10μL加樣槍槍頭尖端在細胞板上劃痕，PBS漂洗2次，每孔加入400μL含不同濃度CoCl2(0、100、200μmol/L)的無血清培養液，另選200μmol/LCoCl2分別以加入10或100μmol/LYC-1(溶于0.1%DMSO)，以200μmol/LCoCl2+0.1%DMSO作為對照。分別于0h、24h在倒置相差顯微鏡下觀察、拍照。

4.3Transwell小室遷移實驗 將A549細胞以1×108/L接種于Transwell上室(Corning)，培養24 h后，下室加入500 μL含YC-1和/或CoCl2的無血清培養液，實驗按如下分組：0、100、200 μmol/L CoCl2組、200 μmol/L CoCl2+YC-1(10、100 μmol/L)組，對照組200 μmol/L CoCl2+0.1% DMSO；培養24 h。取出Transwell小室，棄培養液，甲醇固定20 min，將小室適當風干，0.1%結晶紫染色20 min；自來水洗3遍，棉簽擦盡上室面細胞，光學顯微鏡下隨機選取3個視野，計數小室下室面的細胞數，每組設3復孔，取平均值。

4.4Transwell細胞侵襲實驗 方法與4.3項類似，只是侵襲小室的上室面濾膜用5g/LMatrigel基質膠(北京威格拉斯生物技術有限公司)100μL覆蓋，風干后用于實驗。

4.5胸水和細胞上清Cav-1、HIF-1α濃度的檢測 ELISA法測定Cav-1、HIF-1α濃度，操作步驟參照試劑盒(上海豪森生物科技有限公司)說明書進行。檢測靈敏度下限為1.0 ng/L。

5 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0統計軟件處理，組內兩兩比較均采用q檢驗，2組間均數比較采用獨立樣本t檢驗，雙變量相關分析采用Pearson相關性分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 2組患者胸水中Cav-1、HIF-1α濃度比較及相關性分析

MPE組和TBPE組胸水中Cav-1濃度分別為(95.22±7.94)ng/L、(51.29±5.03)ng/L，HIF-1α濃度分別為(126.92±6.17)ng/L、(96.76±7.20)ng/L；MPE組均明顯高于TBPE組(P<0.05),見圖1；此外，MPE及TBPE中Cav-1與HIF-1α顯著正相關(R=0.8990和0.6560，P<0.01),見圖2。

Figure 1. Comparison of Cav-1 and HIF-1α levels in the pleural effusion of patients.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs TBPE.

Figure 2. Correlation between Cav-1 and HIF-1α in the pleural effusion of patients.

2 CoCl2對肺腺癌A549細胞增殖的影響

分別以不同濃度CoCl2作用A549細胞12、24、48 h，由圖2可見，低濃度CoCl2(<200 μmol/L)短時間(<24 h)誘導的缺氧對A549細胞增殖無明顯抑制作用，而隨著CoCl2濃度增加和作用時間延長，A549細胞增殖呈現時間和劑量依賴性抑制,見圖3。

3 CoCl2影響A549細胞Cav-1、HIF-1α生成的量效關系及兩者相關性

分別以不同濃度CoCl2作用于細胞24 h，作用濃度小于200 μmol/L時，隨濃度增加HIF-1α和Cav-1水平上升，作用濃度大于200 μmol/L則誘導兩者生成的作用減弱；各組Cav-1表達和HIF-1α呈正相關(P<0.05)。以200 μmol/L CoCl2分別作用于A549細胞6 h、12 h、24 h和48 h，隨缺氧時間延長，Cav-1和HIF-1α濃度升高，至24 h達峰值，24 h后兩者濃度均下降。YC-1濃度依賴性抑制CoCl2(200 μmol/L)誘導的HIF-1α和Cav-1水平(P<0.05),見圖4。

Figure 3. The effects of CoCl2 on A549 cells proliferation.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control (0 μmol/L).

Figure 4. The effects of CoCl2 and/or YC-1 on Cav-1 and HIF-1α generation in A549 cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs 0 μmol/L; #P<0.05 vs 6 h; △P<0.05 vs CoCl2 alone.

4 CoCl2對A549細胞遷移能力的影響

細胞劃痕后以不同濃度(0～200 μmol/L) CoCl2或同時加入10、100 μmol/L YC-1作用24 h，隨著CoCl2濃度增高，促進細胞向損傷區域遷移，200 μmol/L CoCl2作用最明顯，YC-1濃度依賴性抑制損傷區域細胞遷移,見圖5。

Figure 5. The effects of CoCl2 and/or YC-1 on A549 cells migration (×200). A: control (0 μmol/L CoCl2); B: 100 μmol/L CoCl2; C: 200 μmol/L CoCl2; D: 200 μmol/L CoCl2+0.1% DMSO; E: 200 μmol/L CoCl2+10 μmol/L YC-1; F: 200 μmol/L CoCl2+100 μmol/L YC-1.

隨著CoCl2濃度增高，穿過微孔膜的細胞數越多，200 μmol/L CoCl2最明顯，YC-1濃度依賴性抑制細胞穿過微孔膜；鏡下計數各組穿過Transwell小室的細胞每個視野個數分別為(63.0±2.9)、(110.0±3.8)、(220.0±10.3)、(144.0±5.1)、(74.0±3.0)，加YC-1后穿過的細胞數較對照組明顯減少(P<0.05),見圖6。

Figure 6. The effects of CoCl2 on A549 cells migration by Transwell assay (×200).Mean±SD.n=3. A: control (0 μmol/L CoCl2); B: 100 μmol/L CoCl2; C: 200 μmol/L CoCl2; D: 200 μmol/L CoCl2+0.1% DMSO; E: 200 μmol/L CoCl2+10 μmol/L YC-1; F: 200 μmol/L CoCl2+100 μmol/L YC-1.*P<0.05 vs control; #P<0.05 vs 200 μmol/L CoCl2+0.1% DMSO.

5 CoCl2對A549細胞體外侵襲的影響

分別以0～200 μmol/L CoCl2或同時加入10、100 μmol/L YC-1作用于A549細胞24 h，發現與上述類似的現象,光鏡下計數穿過聚碳酸酯膜的細胞每個視野的平均個數分別為57.0±5.5、96.0±7.9、197.0±12.7、135.0±8.9和63.0±9.3；隨著CoCl2濃度增高，細胞侵襲數增多，200 μmol/L刺激作用最明顯；YC-1抑制細胞侵襲并呈濃度依賴性,見圖7。

Figure 7. The effects of CoCl2 on the invasion of A549 cells (×200).Mean±SD.n=3. A: control (0 μmol/L CoCl2); B: 100 μmol/L CoCl2; C: 200 μmol/L CoCl2; D: 200 μmol/L CoCl2+0.1% DMSO; E: 200 μmol/L CoCl2+10 μmol/L YC-1; F: 200 μmol/L CoCl2+100 μmol/L YC-1. *P<0.05 vs control; #P<0.05 vs 200 μmol/L CoCl2+0.1% DMSO.

討 論

本研究中，我們檢測了肺癌合并MPE與結核性胸水中Cav-1、HIF-1α水平，發現肺癌合并MPE中Cav-1、HIF-1α濃度均較結核性胸水升高，并且Cav-1與HIF-1α呈正相關。先前的研究也發現，肺癌合并MPE患者胸水中HIF-1α表達升高，免疫組化和免疫熒光分析肺癌組織中惡性程度高、侵襲性強和轉移早的小細胞肺癌HIF-1α的表達強度顯著高于鱗狀細胞癌及腺癌；淋巴結有轉移組HIF-1α的表達強度顯著高于淋巴結無轉移組[7]?？紤]Cav-1和HIF-1α共同在肺癌胸膜轉移中起作用或互為上下游調節基因而發揮作用，推測MPE中高表達的Cav-1、HIF-1α可能與MPE的形成有關。

缺氧是惡性腫瘤最重要的病理特征，CoCl2常用于體外誘導細胞缺氧，其刺激的低氧特征類似于體內低氧微環境[8]。體外模擬缺氧的直接表現是HIF-1α蓄積增加，研究顯示，CoCl2刺激HIF-1α表達在一定范圍內具有時間和劑量相關性，延長作用時間或加大濃度并不增加HIF-1α的水平。

與缺氧密切相關的另一蛋白成分Cav-1是一個頗受爭議的蛋白，在不同腫瘤細胞及不同發展階段顯示抑制或促進腫瘤發展的作用，在多數癌組織及腫瘤細胞系如肺癌[9]中Cav-1表達下降，并且Cav-1的重新表達會抑制癌細胞生長及癌細胞集落的形成，因此認為Cav-1對細胞惡變有抑制作用。已證實Cav-1與癌細胞運動和腫瘤進展有關，在胰腺癌細胞，Cav-1通過失活RhoC GTP酶和ERK-金屬蛋白酶的信號通路抑制細胞遷移和侵襲[4,10]。類似的抑制作用見于乳腺癌MTLn3和MCF-7細胞。然而，Cav-1在肺癌侵襲轉移中的作用，目前報道并不一致，Yeh等[11]將野生型Cav-1基因轉染入小細胞肺癌細胞系NCI-H446中，發現Cav-1調節轉移相關基因E-Cadherin和MMP-3表達及MMP-3酶活性促進NCI-H446體外運動和侵襲能力。相反，Zhang等[12]將Cav-1的siRNA轉染到小鼠Lewis肺癌細胞系P29后ERK1/2和Akt信號通路激活，細胞增殖和運動能力明顯增強。因此，Cav-1在肺癌細胞侵襲轉移中的確切作用和調控機制仍不清楚。另一方面,盡管Cav-1的表達差異可能受癌細胞類型和分期影響, 腫瘤微環境低氧環境可能發揮關鍵作用。

為進一步探討Cav-1在肺癌細胞胸膜侵襲過程中的作用及其生成與HIF-1α的關系，本研究以CoCl2作為細胞缺氧微環境誘導劑，觀察后者是否影響Cav-1、HIF-1α生成進而促進細胞遷移和侵襲。首先觀察了CoCl2對細胞活力的影響情況，發現較低濃度(<200 μmol/L)或作用時間少于24 h時CoCl2對細胞活力影響較小，增加濃度或延長處理時間明顯降低細胞活力。其次，我們發現一定濃度范圍(<200 μmol/L)和作用時間(<24 h)內CoCl2促進Cav-1和HIF-1α表達存在時效和量效關系，高濃度(400 μmol/L)或延長處理時間，兩者表達逐漸下調；這種情況可能與高濃度CoCl2對細胞的毒性作用或長時間缺氧引起負反饋效應有關。此外，CoCl2誘導Cav-1和HIF-1α生成過程中，兩者濃度高度正相關，而同時應用HIF-1α抑制劑YC-1劑量依賴性抑制CoCl2誘導的HIF-1α和Cav-1；上述結果雖然不能直接說明兩者的相互作用關系，也不清楚Cav-1和HIF-1α互相調節的具體機制，但結合兩者與低氧的密切關系及既往研究[5]，提示HIF-1α可能作為Cav-1的上游調節因子影響Cav-1表達。

細胞侵襲是癌癥進展的一個重要方面，低氧條件下癌細胞表現更高的遷移和侵襲能力。在闡述了CoCl2促進Cav-1和HIF-1α生成的量效和時效關系基礎上，通過細胞劃痕及Transwell小室遷移實驗均觀察到一定濃度范圍(<200 μmol/L)內的缺氧誘導劑CoCl2濃度依賴性增強A549細胞遷移，HIF-1α抑制劑YC-1減弱該誘導作用；同樣，體外侵襲實驗得到類似結果，這從一定意義上提示CoCl2誘導生成的Cav-1和/或HIF-1α上調生成的Cav-1與肺癌細胞某些惡性生物學特性有關，可以從黏附、遷移和侵襲環節促進A549細胞的侵襲轉移能力。

總之，本研究結果初步提示Cav-1促進肺癌細胞株A549黏附、遷移和侵襲的作用，也提示其在肺癌并發MPE形成過程中起重要作用，我們的結果還提示HIF-1α在腫瘤細胞運動和Cav-1表達中有重要作用, 這可能對闡明肺癌發展及其胸膜轉移具有重要意義。但Cav-1如何介導肺癌細胞轉移至胸膜腔及MPE中癌細胞表達Cav-1的機制目前尚不清楚，對其進行研究可能有助于開發肺癌相關MPE的治療策略。

[參 考 文 獻]

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