辣椒素對脂多糖誘導血管內皮細胞活化的影響及機制*

盧 陽， 趙光舉， 洪廣亮， 邱俏檬， 李 冬， 盧中秋△

(溫州醫科大學 1附屬第一醫院急診醫學中心， 2 溫州市第三臨床學院風濕免疫科，浙江 溫州 325000)

膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應綜合征，可進一步發展為膿毒性休克及多器官功能障礙綜合征，病死率居高不下。在膿毒癥致病過程中，脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)能夠上調血管內皮細胞(vascular endothelial cells，VECs)NF-κB的表達和活化水平，導致內皮細胞過度、持久及廣泛的活化，是導致循環衰竭和組織器官損傷的關鍵環節[1]。辣椒素(capsaicin, CAP)具有抗炎、抗氧化、鎮痛等廣泛的藥理作用。新近研究發現，辣椒素對NF-κB的表達和活化水平具有重要影響，提示其在膿毒癥內皮細胞損傷中可能極具應用價值[2]。有鑒于此，本項目擬通過研究辣椒素對內毒素誘導血管內皮細胞活化的影響和機制，為其在膿毒癥中的應用提供理論依據。

材 料 和 方 法

1 動物

清潔級ICR小鼠45只，雄性，體重18～22 g，由溫州醫科大學動物中心提供。原代培養的內皮細胞從小鼠主動脈中分離獲取，連續傳至3代。

2 主要試劑

DMEM/F12培養基、胎牛血清以及胰蛋白酶購自Gibco；LPS和CAP(以0.1% DMSO溶解后備用)購自Sigma； von Willebrand 因子(von Willebrand factor, vWF)兔單克隆抗體、NF-κB p65兔多克隆抗體和TATA框結合蛋白(TATA-box-binding protein,TBP)兔多克隆抗體均由Abcam提供；p-IκBα和IκBα兔單克隆抗體由Cell Signaling Technology提供；β-actin兔多克隆抗體以及細胞核蛋白和細胞漿蛋白提取試劑盒均購自中國南京Bioworld 生物公司；RIPA裂解液(強)和BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)均購自中國碧云天生物技術研究所；可溶性細胞間黏附分子1 (soluble intercellular adhesion molecule 1,sICAM-1)、可溶性血管細胞黏附分子1(soluble vascular adhesion molecule 1, sVCAM-1)和可溶性P-選擇素 (soluble P-selectin, sP-selectin)ELISA試劑盒購自R&D Systems，上海西唐生物科技有限公司進口分裝。

3 方法

3.1血管內皮細胞提取培養和鑒定 處死清潔級健康ICR小鼠，分離主動脈并切成1.5 mm×1.5 mm小塊后放入不含膠原酶的6孔板，于貼壁4 h后加入含20%胎牛血清的DMEM/F12完全培養基，培養3 d后去除組織塊，每2 d更換培養基，至細胞融合成單層鋪滿孔底90%以上進行傳代培養。傳代過程中以0.125%胰蛋白酶消化，2～3 min后，輕輕吹打，傳代至1%明膠預先處理的培養瓶，傳代分瓶比例為1∶2。內皮細胞鑒定采用Ⅷ因子相關抗原(即vWF)免疫熒光檢測，陽性信號為綠色熒光。

3.2分組及處理 取第3代內皮細胞，細胞接種于24孔培養板(5×107cells/L，1mL/well)培養12h后去除完全培養基，分為正常組、溶劑對照組、LPS組和LPS+CAP組。其中正常組只加完全培養基；溶劑對照組用與CAP等體積的0.1%DMSO刺激；LPS組用與CAP等體積的0.1%DMSO及100μg/LLPS刺激；LPS+CAP組用100μg/LLPS及不同濃度CAP(50μmol/L、100μmol/L和200μmol/L)同時刺激。分別于刺激后12h、24h和48h留取細胞及上清液備用。

3.3ELISA 取各組的細胞上清液，采用ELISA法檢測上清液中sICAM-1、sVCAM-1和sP-selectin，嚴格按照試劑盒說明書操作。

3.4核蛋白以及胞漿蛋白提取 1 000×g離心5min，收集細胞，用預冷的PBS沖洗2次，吸取上清，加入預冷的細胞漿蛋白提取試劑A和蛋白酶抑制劑，高速漩渦振蕩15s，置冰上10min。加入預冷的細胞漿蛋白提取試劑B后再次高速漩渦振蕩5s，然后4 ℃、12 000×g離心10min，上清即為胞漿蛋白，吸去上清后在沉淀中加入預冷的細胞核蛋白提取試劑和蛋白酶抑制劑，高速漩渦振蕩15s，置冰上40min，每隔10min高速漩渦振蕩15s，4 ℃、12 000×g離心10min，將上清吸入另一離心管，即可得到核蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，-20 ℃保存。

3.5Western blotting 蛋白上樣前加5×上樣緩沖液并煮沸5 min，蛋白上樣量為40 μg；配制10%分離膠和4%濃縮膠(聚丙烯酰胺凝膠)；在濃縮膠中90 V，分離膠中110 V電泳；濕式電泳儀轉膜300 mA、60 min；5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h；Ⅰ抗和內參照抗體4 ℃孵育16 h；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔抗體室溫下孵育1 h；洗膜后ECL試劑盒顯色；曝光成像。Quantity One分析軟件進行灰度值分析，用同一目的蛋白與內參照灰度比值得出此目的蛋白的相對含量。

4 統計學處理

用SPSS 16.0統計軟件分析。數據用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 小鼠主動脈血管內皮細胞的培養和鑒定

原代主動脈血管內皮細胞單層排列，細胞邊界清楚，呈扁平短梭形或多角形，細胞團塊中間較密，周邊細胞多為長梭形并游離向外生長，細胞成鋪路石樣排列，見圖1A。vWF免疫熒光檢查：可見細胞質激發出綠色熒光, 即呈陽性反應,表明vWF存在，證明培養的細胞為內皮細胞，見圖1B。

2 辣椒素對內毒素作用后sP-selectin水平的影響

與對照組相比，內毒素組內皮細胞的sP-selectin顯著升高(P<0.05)，且隨著時間的變化 sP-selectin逐漸升高，LPS可以時間依賴性地上調 sP-selectin水平；與內毒素組相比，50 μmol/L、100 μmol/L和200 μmol/L辣椒素干預組sP-selectin水平顯著降低(P<0.05)，且隨著辣椒素濃度增加，細胞上清液中sP-selectin逐漸降低，見表1。

Figure 1. Cultured endothelial cells of mouse aorta observed under microscope (A;×100) and identified by von Willebrand factor immunofluorescence staining (B;×200).

3 辣椒素對內毒素作用后血管內皮細胞sVCAM-1水平的影響

與對照組相比，內毒素組內皮細胞的sVCAM-1顯著升高(P<0.05)，且隨著時間的變化，sVCAM-1水平逐漸升高；與內毒素組相比，50 μmol/L、100 μmol/L和200 μmol/L辣椒素干預組細胞上清液sVCAM-1含量顯著降低(P<0.05)，見表2。

表1 辣椒素對內毒素作用后可溶性P-選擇素水平的影響

*P<0.05vsDMSO control;#P<0.05vsLPS.

表2 辣椒素對內毒素作用后可溶性ICAM-1水平的影響

*P<0.05vsDMSO control;#P<0.05vsLPS.

4 辣椒素對內毒素作用后血管內皮細胞sICAM-1水平的影響

與對照組相比，內毒素組內皮細胞的sICAM-1顯著升高(P<0.05)，且隨著時間的變化，sICAM-1的水平逐漸升高；與內毒素組相比，50 μmol/L、100 μmol/L和200 μmol/L辣椒素干預組細胞上清液sICAM-1含量顯著降低(P<0.05)，見表3。

表3 辣椒素對內毒素作用后可溶性VCAM-1水平的影響

*P<0.05vsDMSO control;#P<0.05vsLPS.

5 辣椒素對內毒素作用后血管內皮細胞核內NF-κB p65蛋白和胞漿p-IκBα、IκBα蛋白表達的影響

與對照組相比，LPS組細胞核內NF-κB p65蛋白和p-IκBα蛋白水平顯著升高(P<0.05)，LPS組胞漿IκBα蛋白水平顯著降低(P<0.05)。與LPS組相比，50 μmol/L、100 μmol/L和200 μmol/L辣椒素干預組內皮細胞胞核內NF-κB p65和p-IκBα蛋白的表達均有下降，IκBα蛋白表達水平均有升高，其中100 μmol/L和200 μmol/L組顯著差異(P<0.05)，見圖2。

討 論

在膿毒癥致病過程中，炎癥介質(LPS、TNF-α等)能夠誘導血管內皮細胞活化，表現為黏附分子P-選擇素、E-選擇素、ICAM-1、VCAM-1等表達上調[3]。細胞表面的黏附分子脫落進入血液循環或細胞上清中即稱為可溶性黏附分子。研究已經證實，sP-選擇素、sVCAM-1及sICAM-1水平與血管內皮細胞活化狀態密切相關，是細胞活化的重要標志分子[4-5]。黏附分子的上調可促進中性粒細胞、淋巴細胞等多種細胞與血管內皮細胞形成固定黏附，進而遷移進入組織并釋放大量促炎因子、蛋白酶等，進一步加劇血管內皮細胞活化水平，最終導致組織器官損傷的發生[6]。本實驗亦證實，LPS作用后，血管內皮細胞上清液中sP-selectin、sVCAM-1及sICAM-1水平顯著增加，其中sVCAM-1和sICAM-1水平與LPS作用時間密切相關。因此，積極評估血管內皮細胞活化水平并對其進行有效干預，對于膿毒癥的治療無疑具有重要的價值。

辣椒素是辣椒中的主要辛辣部分，其通過結合辣椒素受體釋放多種神經肽而具有抗炎、清除自由基、鎮痛、保護胃黏膜及抗腫瘤等的作用，而其在血管保護中的作用越發受到重視[7]。據報道，辣椒素能夠與血管內皮細胞表面辣椒素受體結合，激活活化蛋白激酶A，增加內皮一氧化氮合成酶的磷酸化和一氧化氮產生，從而改善血管舒張功能[8]。雖然有研究發現，辣椒素單獨作用能夠促進ECV304細胞中sICAM-1的表達[9]，然而其對炎癥狀態下血管內皮細胞活化的影響尚不清楚。本實驗研究發現，辣椒素能夠劑量依賴性下調細胞上清液中sICAM-1、sVCAM-1和sP-selectin的水平，提示辣椒素對于血管內皮細胞活化具有重要的抑制作用，但其最佳劑量仍有待進一步闡明。

Figure 2. The effects of capsaicin (CAP) on the expression of nuclear NF-κB p65 and cytoplasmic p-IκBα and IκBα in the endothelial cells after lipopolysaccharide (LPS) stimulation for 24 h.N: normal; C: DMSO control; TBP: TATA-box-binding protein.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs C; #P<0.05 vs LPS.

眾多轉錄因子參與了感染狀態下宿主的反應，包括NF-κB、ESE-1、AP-1、GATA-2及Erg-1等，其中NF-κB發揮著關鍵性作用[10]。雖然已經證實，轉染IκBα抑制NF-κB的活性能夠顯著提高膿毒癥小鼠的生存率，但其作為內皮細胞保護的干預靶點近年來才得到關注[11]。Ye等[12]發現，特異性阻斷內皮細胞NF-κB活化后，內毒素血癥小鼠內皮細胞黏附分子的表達減低，組織器官損傷程度和死亡率也明顯降低。一般而言，未活化的NF-κB以p65/p50的形式與IκBα存在于細胞漿內。當刺激發生后，IκBα發生磷酸化繼而泛素化降解，使p65/p50與IκBα分離并從細胞漿轉位進入核內發揮轉錄功能[13]。本研究發現，LPS刺激24 h后細胞核內NF-κB p65和胞漿內的p-IκBα的表達水平明顯增高，但胞漿內的IκBα表達水平顯著降低。辣椒素能夠明顯下調細胞核內NF-κB p65胞漿內p-IκBα的水平，升高IκBα表達水平，提示辣椒素對LPS誘導內皮細胞活化的抑制作用可能是通過阻斷NF-κB向細胞核轉位而實現的。

綜上所述，血管內皮細胞活化是膿毒癥致病過程中的關鍵環節。辣椒素能夠有效抑制內毒素誘導的血管內皮細胞NF-κB細胞核轉位，進而下調細胞的活化水平，提示其在膿毒癥治療中可能具有重要的應用價值。

[參 考 文 獻]

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