海南省不同地區橡膠樹內生真菌多樣性研究

李曉娜等

摘 要 從海南省10個縣市的15個不同地點采集橡膠樹RRIM600品系的葉、枝、果、根等組織進行分離培養，共獲得內生真菌507株，415株能夠產生孢子，根據形態特征鑒定為18個屬，23個種，其中絲孢綱真菌9個屬，10個種；腔孢綱真菌6個屬，9個種；子囊菌門真菌3個屬，4個種。初步研究表明：在所研究不同地區的橡膠樹中，穗黑孢霉（Nigrospora oryzae）、樹狀多節孢（Nodulisporium sylviform）、刺盤孢（Colletotrichum sp.）均有分布。不同地區橡膠樹內生真菌定殖率為17%～100%，分離率為0.42～0.97。不同地點橡膠樹中內生真菌群落組成的相似性比較結果表明，地理分布對橡膠樹中內生真菌組成具有一定的影響。

關鍵詞 內生真菌 ；橡膠樹 ；不同地點 ；多樣性

分類號 S794.1 ；S646

Abstract A total of 507 endophytic fungi strains were obtained from leaves， branches， fruits， and roots of rubber tree clone RRIM600 from 15 sample places in 10 cities and counties in Hainan Province. Among them， 415 strains can produce spores. According to their morphological characteristics， 415 strains were identified and classified into 18 genera， 23 species. 9 genera， 10 species belonged to Hyphomycetes， 6 genera， 9 species belonged to Coelomycetes， and 3 genera， 4 species belonged to Ascomycetes. Preliminary studies indicate that Nigrospora oryzae， Nodulisporium sylviform and Colletotrichum sp. were distributed in rubber trees from different sample places. The endophytic fungal colonization rates in the rubber tree from 15 different locations were ranged from 17% to 100%， and the isolation rates from 0.42 to 0.97， respectively. Similarity comparison of endophytic fungi community compositions in rubber tree at different locations suggested geographical distribution has a certain impact on the community composition of endophytic fungi in rubber tree.

Keywords endophytic fungi ； Hevea brasiliensis ； diversity

植物內生真菌（endophytic fungi）是自然界微生物環境的重要組成部分，與植物之間存在密切的互利共生關系，對植物的生理代謝調控和生長發育有較大的影響，某些植物內生真菌的存在還使植物避免或減輕病原真菌的侵染危害，增強宿主植物對病蟲害的抵抗能力[1]。本研究以海南RRIM600品系橡膠樹的葉、枝、果、根等組織為材料，通過研究海南省不同地區同一品系橡膠樹內生真菌的多樣性、群落組成及生態分布規律，國內首次研究橡膠樹中內生真菌對宿主和組織的偏好性，為進一步篩選拮抗菌打下良好的基礎。

1.2.1 消毒

首先將采集的枝條、根、果分別切成5 mm長的小段，葉片打成直徑5 mm的圓片，接著按照以下步驟進行消毒：75%乙醇浸泡1 min、4%活性次氯酸鈉消毒5 min、75%乙醇中浸30 s、滅菌水洗3次[2]。

1.2.2 分離方法的有效性測定

為確保組織塊長出的真菌為橡膠樹的內生真菌，組織表面消毒后用第1次滅菌水洗和最后一次滅菌水洗后的水樣在PAD培養基上畫線，每個處理作3個重復，培養3～5 d后觀察，不長任何細菌或真菌等微生物，證明所用的表面消毒方法有效。

1.2.3 內生真菌的鑒定

內生真菌的形態鑒定根據其菌落大小、顏色、表面特征、質地和生長速度等，結合附著胞、菌絲、子實體、孢子和產孢結構等個體的形態特征，參閱《植物病原真菌學》[3]和《中國的真菌》[4]等文獻進行鑒定。2 結果與分析

2.1 內生真菌定殖率和分離率

在海南省除儋州和烏石外，15個不同地區每個區域各采集3株健康植株的葉、枝條、根和果的660個表面消毒的組織塊中，分離獲得507個內生真菌菌株。從宿主水平看，不同地區的橡膠樹中內生真菌定殖率在39.6%～75%，屯昌橡膠樹中內生真菌定殖率最高為75%，長征農場橡膠樹內生真菌定殖率最低為39.6%；不同地區的橡膠樹中內生真菌分離率在0.52～1.11，白沙膠樹中內生真菌分離率最高達到1.11，昌江橡膠樹內生真菌分離率最低為0.52。從組織水平看，不同地區的橡膠樹內生真菌定殖率以屯昌地區的橡膠樹枝條最高（100%）；不同地區的橡膠樹內生真菌分離率最高的是白沙縣枝條（1.58），其他地點詳情見表1。endprint

2.2 內生真菌的組成

不同地區采集的橡膠樹樣品中內生真菌種類組成不同，共分離得到507株內生真菌中，有415株可產生孢子，通過形態特征鑒定共計18個屬，23個種，其中絲孢綱9個屬，10個種，腔孢綱6個屬，9個種，子囊菌門3個屬，4個種；另有92株內生真菌經組織誘導后仍然不能產孢（18.15%），歸為不產孢類群（Mycelia Sterilia）。研究結果表明：從不同地區采集的橡膠樹組織中分離獲得內生真菌種類和數量均不相同。其中穗黑孢霉（Nigrospora oryzae）、樹狀多節孢（Nodulisporium sylviform）、刺盤孢（Colletotrichum sp.）在不同地區橡膠樹中均有分布。

3 討論

根據相對頻率，在所研究不同地區的橡膠樹中穗黑孢霉（Nigrospora oryzae）、樹狀多節孢（Nodulisporium sylviform）、刺盤孢（Colletotrichum sp.）均有分布。刺盤孢（Colletotrichum sp.）是樂中、文昌地區采集橡膠樹中的優勢種，梨葉點霉（Phyllosticta pirina）是瓊海、屯昌、三更羅、東方大田地區采集橡膠樹中的優勢種，穗黑孢霉（Nigrospora oryzae）是五指山地區采集橡膠樹中的優勢種，擬莖點霉（Phomopsis rich）是大嶺農場、東和農場、昌江、文昌、樂中地區采集橡膠樹中的優勢種，Xylaria sp.是白沙地區采集橡膠樹中的優勢種。

本研究鑒定出不同地點同一品系橡膠樹內生真菌共計18個屬，23個種，分離到的屬和其中的某些種曾在其它植物內生真菌研究中有報道，如從小桐子（Amomum siamense）上分離到黑痣菌屬（Phyllachora）[7]；在熱帶玉米和黃花夾竹桃上分離到黑孢子菌屬（Nigrospora）的種[8]；在東北紅豆杉上分離到炭角菌屬（Xylaria）[9]；在亮毛杜鵑上分離到青霉屬（Penicillium）和曲霉屬（Aspergillus）[10]；在柬埔寨龍血樹上分離到枝孢菌屬（Cladosporium）和黑酵母菌屬（Aureobasidium）[11]；在東北紅豆杉上分離到樹狀多節孢菌（Nodulisporium sylviforme）[12]；在銀杏上分離到，刺盤孢屬（Colletotrichum）[13]；在楓樹（Bpubescens）上分離到擬莖點霉屬（Phomopsis）[14]；在石莼（Ulva sp.）上分離到殼二孢屬（Ascochyta）[15]。從橡膠樹上分離到的這些菌株可以作為開發利用的研究材料。

研究結果表明，不同地區橡膠樹內生真菌的分布具有一定組織偏好性，這種偏好性產生的原因可能是不同地區的光照強度、降雨量、海拔高度、土壤結構等自然條件不同，不同真菌對光照、水分等自然條件的需求也不同，從而影響了內生真菌的侵染、生長和分布。

海南省橡膠樹種植面積廣泛，全面調查橡膠樹內生真菌，進行海南橡膠樹內生真菌多樣性研究，收集大量的橡膠樹內生真菌資源，將為進一步篩選拮抗菌，開發生防菌劑奠定良好的基礎。

參考文獻

[1] 郭良棟. 內生真菌研究進展[J]. 菌物系統，2001，1（20）：148-152.

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[12] 周東坡，平文樣，孫劍秋，等. 紫杉醇產生菌分離的研究[J]. 微生物學雜志，2001，21（1）：18-19.

[13] 王梅霞，陳雙林，閆淑珍，等. 一株產黃酮銀杏內生真菌的分離鑒定與培養介質的初步研究[J]. 南京師范大學學報（自然科學版），2003，26（1）：106-110.

[14] Barengo N， Sieber T N， Holdenrieder O. Diversity of endophytic mycobiota in leaves and twigs of pubescent birch （Betula pubescens）[J]. Sydowia， 2000， 52： 305-320.

[15] Osterhage C， Kaminsky R，Konig G M. Ascasalipyrrolidinone A， an antirnicrobial alkaloid， from the obligate marine fungus Ascochhyta salicorniae[J]. J. Org. Chem， 2000， 65（20）： 6 412-6 417.endprint

2.2 內生真菌的組成

不同地區采集的橡膠樹樣品中內生真菌種類組成不同，共分離得到507株內生真菌中，有415株可產生孢子，通過形態特征鑒定共計18個屬，23個種，其中絲孢綱9個屬，10個種，腔孢綱6個屬，9個種，子囊菌門3個屬，4個種；另有92株內生真菌經組織誘導后仍然不能產孢（18.15%），歸為不產孢類群（Mycelia Sterilia）。研究結果表明：從不同地區采集的橡膠樹組織中分離獲得內生真菌種類和數量均不相同。其中穗黑孢霉（Nigrospora oryzae）、樹狀多節孢（Nodulisporium sylviform）、刺盤孢（Colletotrichum sp.）在不同地區橡膠樹中均有分布。

3 討論

根據相對頻率，在所研究不同地區的橡膠樹中穗黑孢霉（Nigrospora oryzae）、樹狀多節孢（Nodulisporium sylviform）、刺盤孢（Colletotrichum sp.）均有分布。刺盤孢（Colletotrichum sp.）是樂中、文昌地區采集橡膠樹中的優勢種，梨葉點霉（Phyllosticta pirina）是瓊海、屯昌、三更羅、東方大田地區采集橡膠樹中的優勢種，穗黑孢霉（Nigrospora oryzae）是五指山地區采集橡膠樹中的優勢種，擬莖點霉（Phomopsis rich）是大嶺農場、東和農場、昌江、文昌、樂中地區采集橡膠樹中的優勢種，Xylaria sp.是白沙地區采集橡膠樹中的優勢種。

本研究鑒定出不同地點同一品系橡膠樹內生真菌共計18個屬，23個種，分離到的屬和其中的某些種曾在其它植物內生真菌研究中有報道，如從小桐子（Amomum siamense）上分離到黑痣菌屬（Phyllachora）[7]；在熱帶玉米和黃花夾竹桃上分離到黑孢子菌屬（Nigrospora）的種[8]；在東北紅豆杉上分離到炭角菌屬（Xylaria）[9]；在亮毛杜鵑上分離到青霉屬（Penicillium）和曲霉屬（Aspergillus）[10]；在柬埔寨龍血樹上分離到枝孢菌屬（Cladosporium）和黑酵母菌屬（Aureobasidium）[11]；在東北紅豆杉上分離到樹狀多節孢菌（Nodulisporium sylviforme）[12]；在銀杏上分離到，刺盤孢屬（Colletotrichum）[13]；在楓樹（Bpubescens）上分離到擬莖點霉屬（Phomopsis）[14]；在石莼（Ulva sp.）上分離到殼二孢屬（Ascochyta）[15]。從橡膠樹上分離到的這些菌株可以作為開發利用的研究材料。

研究結果表明，不同地區橡膠樹內生真菌的分布具有一定組織偏好性，這種偏好性產生的原因可能是不同地區的光照強度、降雨量、海拔高度、土壤結構等自然條件不同，不同真菌對光照、水分等自然條件的需求也不同，從而影響了內生真菌的侵染、生長和分布。

海南省橡膠樹種植面積廣泛，全面調查橡膠樹內生真菌，進行海南橡膠樹內生真菌多樣性研究，收集大量的橡膠樹內生真菌資源，將為進一步篩選拮抗菌，開發生防菌劑奠定良好的基礎。

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[12] 周東坡，平文樣，孫劍秋，等. 紫杉醇產生菌分離的研究[J]. 微生物學雜志，2001，21（1）：18-19.

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[14] Barengo N， Sieber T N， Holdenrieder O. Diversity of endophytic mycobiota in leaves and twigs of pubescent birch （Betula pubescens）[J]. Sydowia， 2000， 52： 305-320.

[15] Osterhage C， Kaminsky R，Konig G M. Ascasalipyrrolidinone A， an antirnicrobial alkaloid， from the obligate marine fungus Ascochhyta salicorniae[J]. J. Org. Chem， 2000， 65（20）： 6 412-6 417.endprint

2.2 內生真菌的組成

不同地區采集的橡膠樹樣品中內生真菌種類組成不同，共分離得到507株內生真菌中，有415株可產生孢子，通過形態特征鑒定共計18個屬，23個種，其中絲孢綱9個屬，10個種，腔孢綱6個屬，9個種，子囊菌門3個屬，4個種；另有92株內生真菌經組織誘導后仍然不能產孢（18.15%），歸為不產孢類群（Mycelia Sterilia）。研究結果表明：從不同地區采集的橡膠樹組織中分離獲得內生真菌種類和數量均不相同。其中穗黑孢霉（Nigrospora oryzae）、樹狀多節孢（Nodulisporium sylviform）、刺盤孢（Colletotrichum sp.）在不同地區橡膠樹中均有分布。

3 討論

根據相對頻率，在所研究不同地區的橡膠樹中穗黑孢霉（Nigrospora oryzae）、樹狀多節孢（Nodulisporium sylviform）、刺盤孢（Colletotrichum sp.）均有分布。刺盤孢（Colletotrichum sp.）是樂中、文昌地區采集橡膠樹中的優勢種，梨葉點霉（Phyllosticta pirina）是瓊海、屯昌、三更羅、東方大田地區采集橡膠樹中的優勢種，穗黑孢霉（Nigrospora oryzae）是五指山地區采集橡膠樹中的優勢種，擬莖點霉（Phomopsis rich）是大嶺農場、東和農場、昌江、文昌、樂中地區采集橡膠樹中的優勢種，Xylaria sp.是白沙地區采集橡膠樹中的優勢種。

本研究鑒定出不同地點同一品系橡膠樹內生真菌共計18個屬，23個種，分離到的屬和其中的某些種曾在其它植物內生真菌研究中有報道，如從小桐子（Amomum siamense）上分離到黑痣菌屬（Phyllachora）[7]；在熱帶玉米和黃花夾竹桃上分離到黑孢子菌屬（Nigrospora）的種[8]；在東北紅豆杉上分離到炭角菌屬（Xylaria）[9]；在亮毛杜鵑上分離到青霉屬（Penicillium）和曲霉屬（Aspergillus）[10]；在柬埔寨龍血樹上分離到枝孢菌屬（Cladosporium）和黑酵母菌屬（Aureobasidium）[11]；在東北紅豆杉上分離到樹狀多節孢菌（Nodulisporium sylviforme）[12]；在銀杏上分離到，刺盤孢屬（Colletotrichum）[13]；在楓樹（Bpubescens）上分離到擬莖點霉屬（Phomopsis）[14]；在石莼（Ulva sp.）上分離到殼二孢屬（Ascochyta）[15]。從橡膠樹上分離到的這些菌株可以作為開發利用的研究材料。

研究結果表明，不同地區橡膠樹內生真菌的分布具有一定組織偏好性，這種偏好性產生的原因可能是不同地區的光照強度、降雨量、海拔高度、土壤結構等自然條件不同，不同真菌對光照、水分等自然條件的需求也不同，從而影響了內生真菌的侵染、生長和分布。

海南省橡膠樹種植面積廣泛，全面調查橡膠樹內生真菌，進行海南橡膠樹內生真菌多樣性研究，收集大量的橡膠樹內生真菌資源，將為進一步篩選拮抗菌，開發生防菌劑奠定良好的基礎。

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