進境旅客攜帶的澳大利亞蘋果中美澳型核果褐腐病菌的檢測與鑒定

許萍萍 李彬 吳翠萍 漆少廷 羅朝科 羅建國 安榆林

摘要：南京祿口國際機場口岸從進境旅客攜帶的澳大利亞蘋果中截獲疑似褐腐病果。病果表面靠近果肩處有水漬狀褐色病斑，經保濕培養后褐色病斑迅速擴展至全果，果實表面出現灰褐色絨狀霉層，果實腐爛。對病果進行分離培養、形態學觀察、PCR檢測及ITS序列分析和致病性測定后，將病菌鑒定為美澳型核果褐腐病菌（Monilinia fructicola）。這是江蘇省首次從旅客攜帶的澳大利亞蘋果中截獲該檢疫性有害生物。

關鍵詞：蘋果病害；真菌鑒定；旅檢；美澳型核果褐腐病菌

中圖分類號： S41-3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0119-03

收稿日期：2013-09-06

作者簡介：許萍萍（1982—），女，江蘇鹽城人，碩士，農藝師，主要從事植物檢疫工作。E-mail：xupp@jsciq.gov.cn。褐腐病是桃、李、杏、蘋果等果樹上的一種危害嚴重的水果病害，引起該病害的病原菌之一的美澳型核果褐腐病菌（Monilinia fructicola）是我國進境植物檢疫性有害生物，該病原菌的主要寄主為薔薇科果樹，尤其以核果類李屬（Prunus）的李、杏、桃、油桃、櫻桃、蘋果、梨和葡萄等果樹受害最嚴重，曾對北美和澳大利亞的核果造成巨大損失。美澳型褐腐病菌既能在果園中引起危害，又能危害儲藏期果實，并可在果實中潛伏侵染，隨病果遠距離傳播，美澳型核果褐腐病菌目前在日本、印度、韓國、美國、加拿大、澳大利亞、新西蘭、法國等多個國家均有分布，我國北京和臺灣地區也有局部發生危害的報道[1]。該病菌可隨帶病的苗木及水果通過貿易和旅客攜帶進行遠距離傳播。2013年6月，南京祿口國際機場口岸從進境旅客攜帶的澳大利亞蘋果中截獲一批可疑病果。為防止美澳型核果褐腐病菌傳入我國，筆者對病果及其分離物進行了分離培養、病原菌形態學觀察、PCR分子檢測，并遵循柯赫氏法則進行致病性測定，對這批病蘋果攜帶的病菌進行了檢測和鑒定。

1材料與方法

1.1材料與試劑

材料為南京祿口國際機場從進境旅客攜帶的澳大利亞蘋果中截獲的可疑病果。培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基。

1.2癥狀檢查及保濕培養

對可疑病果的癥狀進行觀察，取有褐色病斑的果實直接進行分離培養。病果初期有褐色病斑，溫度適宜時，褐色病斑迅速擴大至全果，果肉隨之變軟腐爛。潮濕條件下，病果表面凹陷處有灰色霉層，其上產生分生孢子梗束。有些潛伏侵染的果實表面暫時無明顯癥狀，對這類果實可進行保濕培養，將果實放在密閉的塑料盒中，20～25 ℃下保濕培養，7 d 后開始每天檢查，直至出現褐腐病斑癥狀，再對果實進行分離培養。

1.3組織分離與培養

取有褐色病斑的果實進行分離培養，用70%乙醇對果實表面進行消毒，等乙醇揮發后，從病健交界處切取或用鑷子撕取邊長為5～10 mm 的樣品，放在PDA培養基上，25 ℃培養，待菌落出現鏡檢。

1.4形態學觀察與生物學鑒定

如果菌落上的分離物形態特征與美澳型核果褐腐病菌相似，則對疑似菌株進行純化，并對菌落的顏色、生長速度、產孢量和孢子堆的形狀等菌落形態學特征和生物學性狀進行觀察和測定。先將轉到PDA 上的美澳型核果褐腐病菌疑似菌株放在22 ℃下暗培養4 d，用4 mm的打孔器在菌落邊緣打孔取樣，將菌落轉移至直徑為9 cm的PDA 培養皿中央，22 ℃下12 h光照/12 h暗培養，光照波長為320～380 nm、18 W黑光燈（近紫外燈）2盞，置于培養皿上方約15 cm處，培養3 d后開始每天測量菌落直徑，直到第5天開始計算并記錄菌落的生長速度、顏色、產孢量、孢子堆形狀。

1.5分子生物學鑒定

1.5.1DNA提取采用Tooley等的堿裂解法[2]直接從培養基中快速提取菌絲DNA。疑似菌株經純化后在PDA上生長 2 d，取菌絲塊放入2 mL的離心管中，加入50 μL的0.5 mol/L NaOH和2粒以上直徑為3 mm的鋼珠，在球磨儀（Retsch MM400，德國）上以30 f/s的頻率振蕩180 s，12 000 r/min離心5 min，取10 μL上清液直接溶于90 μL 100 mmol/L Tris溶液（pH值8.0）中。也可以采用CTAB 方法或真菌基因組提取試劑盒（如DNeasy Plant Mini Kit，QIAGEN，德國）提取病菌DNA。DNA提取后直接進行PCR檢測或-20 ℃保存備用。

1.5.2PCR引物根據文獻[1]中推薦的方法，對分離到的疑似菌株采用PCR檢測方法進行鑒定。美澳型核果褐腐病菌的特異性引物ITS1-Mfcl 和ITS4-Mfcl 序列為5′-TATGCTCGCCAGAGGATAATT-3′和5′-TGGGTTTTGGCAGA-AGCACACT- 3′，預期擴增的PCR產物大小為 356 bp，PCR 引物由南京金斯瑞生物科技有限公司代為合成。

1.5.3PCR擴增50 μL PCR 反應體系中含有1×PCR緩沖液（無Mg2+）、1.5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTP、各引物0.2 μmol/L、1.25 U Taq DNA聚合酶、2 μL DNA溶液，補ddH2O至反應總體積為50 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，67.5 ℃復性30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，30個循環；72 ℃延伸10 min。

1.5.4PCR產物的檢測PCR反應結束后，將PCR擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測， 用凝膠成像儀觀察、拍照、記錄檢測結果。

1.5.5PCR產物核苷酸序列分析PCR 產物純化后委托南京金斯瑞生物科技有限公司進行核苷酸序列測定。采用BioEdit和DNAStar軟件對測序結果與GenBank發表的美澳型核果褐腐病菌ITS核苷酸序列進行比較和同源性分析。

1.6致病性測定

采用菌絲塊接種法，用4 mm的打孔器在菌落邊緣打孔取樣，作為接種菌絲塊。選用新鮮健康的蘋果果實，先用70%乙醇對要接種的果實表面進行消毒，再用解剖刀切開接種部位切取少量果肉，將菌絲塊接入果肉中，將接種的蘋果放入密閉塑料盒中，22 ℃下保濕培養。同時設置空白對照。

2結果與分析

2.1病果癥狀

截獲的病果初期有褐色病斑，經保濕培養后4 d，褐色病斑迅速擴大至全果，果實表面凹陷處密布灰褐色絨狀霉層（圖1），其上產生大量分生孢子梗束，果肉隨之變軟腐爛。

2.2病菌生物學特性

2.2.1菌落特征取病果病健交界處果皮進行組織分離，對疑似美澳型核果褐腐病菌菌落進行純化，取直徑4 mm菌絲塊在PDA 上22 ℃光暗交替培養，菌落生長速度很快，7 d后菌落布滿直徑 9 cm 培養皿。菌落榛子色或灰褐色，邊緣較整齊，產孢量豐富，菌落表面形成明顯的同心輪紋狀分生孢子堆（圖2）。菌株的培養特性與van Leeuwen等描述的美澳型核

果褐腐病菌的菌落特征[3-4]一致。

2.2.2病菌形態經顯微鏡觀察，疑似菌株菌絲無色，有分枝，分生孢子梗較短，頂端串生分生孢子，芽生，鏈狀排列，檸檬形或卵圓形，近無色，單胞（圖3）。分生孢子為 10.28～19.65 μm × 6.62 ～ 14.60 μm，平均值為14.70 μm × 9.79 μm。分生孢子萌發產生后產生的芽管較長。病菌的形態學特征與已報道的美澳型核果褐腐病菌的形態特征[1，3，5]完全相符。

2.3病菌PCR分子檢測及序列分析

2.3.1病菌PCR檢測采用美澳型核果褐腐病菌特異性引物ITS1-Mfc1和ITS4-Mfc1對疑似菌株進行PCR分子檢測。結果表明，PCR擴增出1條大小為356 bp的特異性目的條帶，與陽性對照大小一致（圖4）。將PCR產物送往南京金斯瑞生物科技有限公司純化測序。

2.3.2病菌PCR 產物序列測定與同源性分析PCR 產物經測序和BLAST 分析，結果表明，PCR 產物核苷酸序列與 GenBank 中40多個美澳型核果褐腐病菌已知的ITS基因序列（GenBank登錄號：JN176556、HQ846919、GU967379、GQ979713、FJ515894、AM887528、DQ314727等）同源性均為100%。序列比對的結果進一步驗證了PCR 產物是美澳型核果褐腐病菌的特異性產物。

2.4致病性測定

采用菌絲塊對新鮮健康的蘋果果實進行接種，經保濕培養， 蘋果果實3～4 d出現褐色病斑，病斑擴展迅速， 8 d后整

個果實表面全部變為褐色，12 d后果實表面被散生的灰裼色絨狀霉層覆蓋（圖5），其上產生大量分生孢子堆，果實腐爛。空白對照無褐腐癥狀出現，也無絨狀霉層產生。從接種發病的蘋果果實上可重新分離到疑似美澳型核果褐腐病菌菌株，病菌的生物學特性與接種病菌完全相同。

3結論與討論

美澳型核果褐腐病菌有3個近似種，即核果鏈核盤菌（M.laxa）、果生鏈核盤菌（M. fructigena）和 M.polystroma。這4個種可通過菌落特征、分生孢子大小、分生孢子萌發產生的芽管、產孢量和PCR特異性擴增來加以區分[1，3-6]，通過ITS序列及微衛星序列差異建立的常規PCR方法[1，5-7]、SYBR實

時PCR方法[8]和Taq Man-MGB探針[9]等PCR檢測方法可以快速、準確地在種的水平上將這4個近似種區分開來。

美澳型核果褐腐病菌是我國進境植物檢疫性有害生物，該病原菌主要危害核果類李屬果樹，會給果園造成巨大損失。除了蘋果以外，我國口岸多次從旅客攜帶的李、櫻桃、西梅及進境貿易水果（葡萄、李和櫻桃）貨物中截獲過該病菌[5，10-12]。該病菌既能在果園中引起危害，又能危害儲藏期果實，并可在果實中潛伏侵染，隨病果遠距離傳播。進境旅客攜帶的水果雖然數量少，但是水果種類多，來源廣，產地復雜，美澳型核果褐腐病菌隨水果傳入的疫情風險很高，所以我國各口岸應加強對入境旅客攜帶水果的檢疫，防止通過旅客攜帶的水果將該病菌傳入我國，以保護我國水果生產和貿易的安全。

參考文獻：

[1]SN/T 1871—2007 美澳型核果褐腐病菌檢疫鑒定方法[S]. 北京：中國標準出版社，2007.

[2]Tooley P W，Bunyard B A，Carras M M，et al. Development of PCR primers from internal transcribed spacer region 2 for detection of Phytophthora species infecting potatoes[J]. Applied Environment Microbiology，1997，63（4）：1467-1475.

[3]van Leeuwen G C M，van Kesteren H A.Delineation of the three brown rot fungi of fruit crops（Monilinia spp.）on the basis of quantitative characteristics[J]. Canadian Journal of Botany，1998，76（12）：2042-2050.

[4]van Leeuwen G M，Baayen R P，Holb I J，et al. Distinction of the asiatic brown rot fungus Monilia polystroma sp. nov.from M. fructigena[J]. Mycology Research，2002，106（4）：444-451.

[5]王衛芳，章柱，余辛.從進境美國櫻桃中首次截獲美澳型核果褐腐病菌[J]. 植物檢疫，2012，26（5）：88-91.

[6]Ioos R，Frey P.Genomic variation with Monilinia laxa，M.fructigena and M.fructicola，and application to species identification by PCR[J]. European Journal of Plant Pathology，2000，106 （4）：373-378.

[7]樊錦艷，朱小瓊，國立耘，等. 褐腐病菌三種分子鑒定方法的比較[J]. 植物保護學報，2007，34（3）：289-295.

[8]Luo Y，Ma Z，Reyes H C，et al. Quantification of airborne spores of Monilinia fructicola in stone fruit orchards of California using real-time PCR[J]. European Journal of Plant Pathology，2007，118（2）：145-154.

[9]程穎慧，王穎，章桂明，等. 應用TaqMan MGB探針檢測美澳型核果褐腐病菌[J]. 廣東農業科學，2009（7）：196-198.

[10]田利華，周國梁，黃建康，等. 進口智利李子上核果褐腐病菌鑒定[J]. 植物檢疫，2008，22（4）：201-204，封3.

[11]張慧麗，張建成，顧建鋒，等. 李褐腐病病原菌的分離和鑒定[J]. 中國果樹，2008（2）：68-69，75.

[12]王衛芳，章柱，余辛，等. 2010年廣東口岸從進境美國水果中截獲多種檢疫性真菌有害生物[J]. 植物檢疫，2011，25（3）：