親水作用液相色譜法測(cè)定板藍(lán)根顆粒中腺苷含量

李媛媛+馬玉龍+李嬌

摘要：采用自制的負(fù)載納米碳（CNPs）的親水色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm 粒徑，10 nm 孔徑），建立了親水作用液相色譜法（HILIC）測(cè)定板藍(lán)根配方顆粒中腺苷含量的方法。結(jié)果表明：腺苷濃度在 2.5～20.0 μg/mL時(shí)，腺苷濃度與親水作用液相色譜法測(cè)定的峰值線性關(guān)系良好，平均回收率97.63%，RSD=4.08%（n=9）。所建立的親水作用液相色譜法分離效果好、快速簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，結(jié)果可靠，可為進(jìn)一步完善板藍(lán)根顆粒制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：親水作用液相色譜；板藍(lán)根顆粒；腺苷；方法學(xué)驗(yàn)證

中圖分類號(hào)： O655；O657.7+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）06-0284-03

收稿日期：2013-09-29

基金項(xiàng)目：寧夏大學(xué)科學(xué)研究基金（編號(hào)：ZR1207）。

作者簡(jiǎn)介：李媛媛（1980—），女，寧夏中寧人，博士，講師，主要從事天然植物和藥物有效成分的分析與分離研究工作。E-mail：liyy@nxu.edu.cn。板藍(lán)根顆粒為板藍(lán)根單味藥材水提醇沉加工而成，具有清熱解毒、涼血利咽之功效[1]。板藍(lán)根配方顆粒作為防病治病的物質(zhì)載體，是一個(gè)極其復(fù)雜的混合物體系，其主要化學(xué)成分有：靛藍(lán)、靛玉紅、丁香酸、喹唑酮酸、精氨酸等[2]。目前，中國(guó)藥典對(duì)板藍(lán)根的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)只檢測(cè)告依春。有報(bào)道采用測(cè)定靛藍(lán)或靛玉紅的含量來(lái)控制其質(zhì)量[3]，由于板藍(lán)根顆粒采用水提醇沉工藝，而靛藍(lán)或靛玉紅為脂溶性成分，因此靛藍(lán)或靛玉紅含量的多少難以客觀、準(zhǔn)確地表征該制劑的內(nèi)在質(zhì)量。已有研究結(jié)果表明，板藍(lán)根配方顆粒中水溶性核苷類成分——腺苷也是板藍(lán)根中抗病毒的活性成分之一，具有抗凝血、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、松弛支氣管平滑肌、鎮(zhèn)靜中樞神經(jīng)和抗心率不齊的作用，并且其含量能夠反映板藍(lán)根中核苷類的含量水平，可以作為評(píng)價(jià)板藍(lán)根配方顆粒的一種指標(biāo)[4]。

關(guān)于核苷類物質(zhì)含量測(cè)定的常用方法是RPLC法和CZE法，但是RPLC只是依靠單一的疏水作用力來(lái)實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的分離，對(duì)極性物質(zhì)無(wú)法保留或者保留很弱。雖然可以使用正向色譜來(lái)分析，但是正相色譜通常使用非極性的溶劑做流動(dòng)相，極性的分析物很難溶解于非極性的流動(dòng)相，而且與質(zhì)譜也不兼容。因此，極大的限制了正相色譜的應(yīng)用。親水作用色譜（HILIC），是一種新型的色譜模式。類似于正相色譜，在親水色譜柱上，極性化合物有強(qiáng)保留。不同之處在于，正相色譜所使用的非極性流動(dòng)相體系被水和有機(jī)溶劑的體系所代替。這樣就可以解決極性和親水性分析物在正相色譜體系中不溶解的問(wèn)題，并且與質(zhì)譜也有好的兼容性[5-7]。親水作用色譜，作為對(duì)反相色譜的補(bǔ)充和正相色譜的替代，已經(jīng)顯示出巨大的優(yōu)越性和潛力，成為分析極性和親水性化合物的一種強(qiáng)有力的色譜技術(shù)[8-9]。

目前，使用親水作用色譜檢測(cè)板藍(lán)根中腺苷含量未見(jiàn)報(bào)道。本研究在自制的親水作用色譜柱上，固定相以硅膠為載體，負(fù)載納米碳（CNPs）作為固定相[10]，應(yīng)用HILIC法測(cè)定板藍(lán)根中腺苷含量，為完善板藍(lán)根的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

色譜分析在瓦里安高效液相色譜儀 （Varian，美國(guó)） 上完成。儀器由2臺(tái) Prostar 210型高壓梯度泵、1個(gè)77251型進(jìn)樣閥（配備20 μL進(jìn)樣環(huán)）、1臺(tái)Prostar 325型紫外檢測(cè)器和1套色譜數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)（Starws）組成。超聲清洗器購(gòu)買于昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

試驗(yàn)過(guò)程中使用的超純水均來(lái)自MILLI-Q超純水系統(tǒng)（Millipore，Bedford，MA，美國(guó)）。高效液相色譜儀器的流動(dòng)相為乙腈 （色譜級(jí)，迪馬科技，美國(guó)） 和超純水的混合物，流動(dòng)相和測(cè)試化合物在使用前均使用0.45 μm的過(guò)濾膜過(guò)濾。對(duì)照品腺苷購(gòu)買于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。板藍(lán)根顆粒1袋（10 g），市售。

1.2腺苷保留行為考察

在HILIC中，流動(dòng)相的洗脫強(qiáng)度對(duì)極性和親水性化合物的保留有最大的影響，因?yàn)殡S著流動(dòng)相極性的減小，親水作用逐漸增強(qiáng)。如圖1所示，當(dāng)流動(dòng)相中乙腈含量從50%增加到80%時(shí)，腺苷的保留值逐漸增加。當(dāng)乙腈含量增加至80%以上時(shí)，腺苷的保留值顯著增加，這主要受親水作用控制，是典型的HILIC 的特征。當(dāng)流動(dòng)相中乙腈含量小于50%時(shí)，化合物的保留隨著流動(dòng)相中乙腈含量的減少而增加，這主要受疏水作用控制。當(dāng)流動(dòng)相中乙腈含量為50% 時(shí)，分析物在固定相上的保留是最弱的，這是RPLC和HILIC兩種色譜模式的分界線。因?yàn)楫?dāng)乙腈含量為50% 時(shí)，水和乙腈都在固定相表面達(dá)到飽和，液液分配作用或者吸附作用都是最弱的。類似的“U”形保留曲線，在許多親水固定相上觀察到[11-12]，這是混合保留模式的典型特征。

1.3色譜條件

色譜柱為自制的固載CNPs的硅膠柱（150 mm×4.6 mm，5 μm 粒徑，10 nm 孔徑）；流動(dòng)相為乙腈-水（90 ∶10，體積比）；流速1.0 mL/min；室溫；檢測(cè)波長(zhǎng) 254 nm。在此條件下，樣品中腺苷與其他組分獲得了滿意的分離效果，分離結(jié)果見(jiàn)圖2。

2結(jié)果與分析

2.1腺苷濃度與色譜峰面積的線性關(guān)系

精確稱取腺苷對(duì)照品10 mg，置10 mL容量瓶中，以乙腈-水（50 ∶50，體積比）溶解，定容，搖勻即得腺苷對(duì)照品貯備液。再分別精確量取對(duì)照品貯備液 25、50、75、100、125、150、175、200 μL置10 mL量瓶中，用 50%乙腈稀釋至刻度，搖勻，分別吸取10 μL 注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積值，并以對(duì)照品的濃度 X（μg/mL）與峰面積Y（mAU）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=2.643×105X-1.454×105，r=0.999 1。說(shuō)明腺苷濃度在 2.5～20.0 μg/mL時(shí)，液相色譜測(cè)定的峰面積值與腺苷濃度線性關(guān)系良好。endprint

2.2腺苷提取方法

分別精確稱取同一批號(hào)的板藍(lán)根顆粒3份各1.0 g，分別加超純水、50%乙腈、20% 乙腈適量，超聲溶解，再分別加入上述溶劑至刻度，搖勻，用微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣。結(jié)果表明超純水提取最完全，含腺苷最高。然后再分別精確稱取同一批號(hào)的板藍(lán)根顆粒3份各1.0 g，加入超純水10 mL，分別超聲提取40、60、80 min，提取結(jié)束后，加超純水補(bǔ)足，過(guò)濾，取濾液檢測(cè)。腺苷的提取量隨超聲提取時(shí)間增加而增多，但到60 min后提取效率不再增加，因此，板藍(lán)根顆粒采用超純水超聲處理 60 min 提取腺苷。

2.3精密度

取腺苷對(duì)照品溶液10 μL，進(jìn)行親水作用液相色譜法測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣5次，結(jié)果表明，RSD為1.69%。表明儀器精密度良好。

2.4穩(wěn)定性

取板藍(lán)根顆粒樣品，研細(xì)，精確稱取適量（約1.0 g）置 10 mL 量瓶中，加適量水，超聲處理60 min，搖勻，加水至刻度，0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液。精確吸取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12 h進(jìn)樣，結(jié)果顯示，RSD為1.24%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5重現(xiàn)性

精確稱取同一批號(hào)的板藍(lán)根顆粒5份，約每份1.0 g，制備供試品溶液，測(cè)定腺苷含量，RSD為3.94%（n=5），表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.6回收率

精確稱取已知腺苷含量的供試樣品9份，每份約0.5 g，分別精確加入腺苷對(duì)照品溶液。由表1可知，腺苷平均回收率為97.63%。表1腺苷回收率測(cè)定結(jié)果

編號(hào)板藍(lán)根顆粒

（g）板藍(lán)根顆粒中腺苷量

（μg/mL）加入腺苷對(duì)照品量

（μg/mL）測(cè)得量

（μg/mL）回收率

（%）RSD

（%）10.499 96.6695.00011.82103.0020.500 86.6815.00011.70100.4030.500 06.6705.00011.72100.9040.501 26.68610.00015.7690.7150.502 06.69710.00016.1694.6660.499 66.66510.00016.6499.8170.501 66.69116.00022.4298.2880.500 46.67516.00021.6293.3990.501 66.69116.00022.2897.42平均97.634.08

2.7樣品含量測(cè)定結(jié)果

分別對(duì)不同廠家生產(chǎn)的板藍(lán)根顆粒進(jìn)行親水作用液相色譜法測(cè)定，結(jié)果（表2）表明，不同廠家生產(chǎn)的板藍(lán)根顆粒中腺苷含量差異很大，即使是同一廠家生產(chǎn)的不同批次的板藍(lán)根顆粒之間也存在較大差異。因此，板藍(lán)根制劑的批次間穩(wěn)定性有待提高，以保障板藍(lán)根臨床用藥的療效。

表2親水作用液相色譜法測(cè)定的板藍(lán)根顆粒中腺苷含量

廠家板藍(lán)根取樣量

（g）腺苷測(cè)得量

（μg）腺苷含量

（μg/g）A0.999 3289.030289.23B0.999 1220.630220.83C1.000 6133.490133.41D（Ⅰ）1.006 3105.750105.09D（Ⅱ）1.000 925.46125.438D（Ⅲ）0.999 575.13175.168

3結(jié)論

腺苷為板藍(lán)根配方顆粒中的活性成分之一，由于板藍(lán)根顆粒大部分是水溶性，常用的RPLC法對(duì)于一些強(qiáng)極性和水溶性物質(zhì)無(wú)法保留，或者需要使用高的緩沖濃度。本試驗(yàn)首次使用親水作用色譜法，在低的緩沖濃度體系中，對(duì)板藍(lán)根顆粒中腺苷含量進(jìn)行了測(cè)定。為了更好地控制該制劑的質(zhì)量，采用自制的固載 CNPs 的硅膠固定相，對(duì)其中水溶性成分腺苷作為含量測(cè)定的指標(biāo)成分。結(jié)果表明：HILIC法是一種適用于強(qiáng)極性和強(qiáng)親水性樣品定性定量分析的可靠手段，該方法方便快捷，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性好，可為進(jìn)一步完善該制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]苗愛(ài)東，巴林，彭燕，等. RP-HPLC測(cè)定板藍(lán)根顆粒中腺苷的含量[J]. 華西藥學(xué)雜志，2005，20（5）：434-436.

[2]丁水平，劉云海，李敬，等. 板藍(lán)根化學(xué)成分研究（Ⅱ）[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2001，32（8）：475-476.

[3]馬莉，孫琴，李友，等. HPLC測(cè)定板藍(lán)根提取物中靛藍(lán)和靛玉紅的含量[J]. 藥物分析雜志，2010，30（9）：1642-1645.

[4]張葉，張蕾，王玉. RP-HPLC法測(cè)定板藍(lán)根藥材中腺苷和表告依春的含量[J]. 藥物分析雜志，2008，28（11）：1848-1850.

[5]Mccalley D V. Study of the selectivity，retention mechanisms and performance of alternative silica-based stationary phases for separation of ionised solutes in hydrophilic interaction chromatography[J]. Journal of Chromatography，2010，1217（20）：3408-3417.

[6]Chauve B，Guillarme D，Cléon P，et al. Evaluation of various HILIC materials for the fast separation of polar compounds[J]. Journal of Separation Science，2010，33（6/7）：752-764.endprint

[7]Jandera P. Stationary and Mobile phases in hydrophilic interaction chromatography：a review[J]. Analytica Chimica Acta，2011，692（1/2）：1-25.

[8]Ikegami T，Tomomatsu K，Takubo H，et al. Separation efficiencies in hydrophilic interaction chromatography[J]. Journal of Chromatography，2008，1184（1/2）：474-503.

[9]Mccalley D V. The challenges of the analysis of basic compounds by high performance liquid chromatography：some possible approaches for improved separations[J]. Journal of Chromatography，2010，1217（6）：858-880.

[10]Li Y Y，Xu L A，Chen T，et al. Carbon nanoparticles from corn stalk soot and its novel application as stationary phase of hydrophilic interaction chromatography and per aqueous liquid chromatography[J]. Analytica Chimica Acta，2012，726：102-108.

[11]Kwon S H，Park J H. Intermolecular interactions on multiwalled carbon nanotubes in reversed-phase liquid chromatography[J]. Journal of Separation Science，2006，29（7）：945-952.

[12]Chang Y X，Ren C X，Ruan Q，et al. Effect of single-walled carbon nanotubes on cellulose phenylcarbamate chiral stationary phases[J]. Chemical Research in Chinese Universities，2007，23（6）：646-649.endprint

[7]Jandera P. Stationary and Mobile phases in hydrophilic interaction chromatography：a review[J]. Analytica Chimica Acta，2011，692（1/2）：1-25.

[8]Ikegami T，Tomomatsu K，Takubo H，et al. Separation efficiencies in hydrophilic interaction chromatography[J]. Journal of Chromatography，2008，1184（1/2）：474-503.

[9]Mccalley D V. The challenges of the analysis of basic compounds by high performance liquid chromatography：some possible approaches for improved separations[J]. Journal of Chromatography，2010，1217（6）：858-880.

[10]Li Y Y，Xu L A，Chen T，et al. Carbon nanoparticles from corn stalk soot and its novel application as stationary phase of hydrophilic interaction chromatography and per aqueous liquid chromatography[J]. Analytica Chimica Acta，2012，726：102-108.

[11]Kwon S H，Park J H. Intermolecular interactions on multiwalled carbon nanotubes in reversed-phase liquid chromatography[J]. Journal of Separation Science，2006，29（7）：945-952.

[12]Chang Y X，Ren C X，Ruan Q，et al. Effect of single-walled carbon nanotubes on cellulose phenylcarbamate chiral stationary phases[J]. Chemical Research in Chinese Universities，2007，23（6）：646-649.endprint

[7]Jandera P. Stationary and Mobile phases in hydrophilic interaction chromatography：a review[J]. Analytica Chimica Acta，2011，692（1/2）：1-25.

[8]Ikegami T，Tomomatsu K，Takubo H，et al. Separation efficiencies in hydrophilic interaction chromatography[J]. Journal of Chromatography，2008，1184（1/2）：474-503.

[9]Mccalley D V. The challenges of the analysis of basic compounds by high performance liquid chromatography：some possible approaches for improved separations[J]. Journal of Chromatography，2010，1217（6）：858-880.

[10]Li Y Y，Xu L A，Chen T，et al. Carbon nanoparticles from corn stalk soot and its novel application as stationary phase of hydrophilic interaction chromatography and per aqueous liquid chromatography[J]. Analytica Chimica Acta，2012，726：102-108.

[11]Kwon S H，Park J H. Intermolecular interactions on multiwalled carbon nanotubes in reversed-phase liquid chromatography[J]. Journal of Separation Science，2006，29（7）：945-952.

[12]Chang Y X，Ren C X，Ruan Q，et al. Effect of single-walled carbon nanotubes on cellulose phenylcarbamate chiral stationary phases[J]. Chemical Research in Chinese Universities，2007，23（6）：646-649.endprint