響應面優化酶法提取靈芝多糖工藝條件

呂興萍+楊薇紅+馬春嬌

摘要：根據單因素試驗結果，選用提取時間、提取溫度、酶量3個反應因素作為研究對象，以多糖提取率為考察指標，通過響應面分析方法優化靈芝多糖的提取工藝條件。結果表明，最佳提取條件為提取溫度51 ℃、酶量180%、提取時間2.5 h。在最佳工藝條件下，多糖提取率可達11.25%。

關鍵詞：靈芝多糖；酶法提取；響應面分析

中圖分類號： R284.2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0258-02

收稿日期：2013-09-16

基金項目：江蘇農林職業技術學院科技項目（編號：2010c09）。

作者簡介：呂興萍（1981—），女，江蘇海安人，碩士，講師，主要從事中藥新劑型研究。E-mail：xingping8702007@sohu.com。靈芝（Ganoderma lucidum）是擔子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌赤芝和紫芝的總稱，具有扶正固本等功效。靈芝多糖是靈芝的主要活性成分，具有免疫調節、抗輻射、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老以及活血化瘀等廣泛的藥理活性[1-5]，因此靈芝多糖是目前靈芝研究的熱點之一。目前靈芝多糖的提取方法主要是傳統的水提醇沉法，此外還有膜分離法、酶解法、超聲法、微波法等。其中，酶解法通過酶解破壞細胞結構來強化有效成分的傳質過程，較大幅度提高多糖得率，不易破壞多糖的立體結構和生物活性[6]。響應面法以最經濟的方式、較少的試驗次數和較短的時間對所選的試驗參數進行全面研究[7]。本試驗擬采取酶解法提取靈芝多糖，以靈芝多糖提取率響應值為研究對象，應用響應面法對靈芝多糖的提取條件進行優化，以期得到靈芝多糖最佳提取工藝參數。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

HY-02型高速粉碎機（北京環亞天元機械技術有限公司），上海菁華754分光光度計，電子天平，HH-S型恒溫水浴鍋（江蘇金壇市金城國盛實驗儀器廠），SHZ-IIIB循環式多用真空泵（浙江省臨海市譚氏真空設備有限公司）。

靈芝子實體（江蘇農林職業技術學院食用菌研究所）；纖維素酶（活性≥400 U/mg）；濃硫酸、苯酚、無水葡萄糖、乙醇均為國產分析純。

1.2試驗方法

1.2.1靈芝多糖的提取將干燥的靈芝切片在高速粉碎機下粉碎至一定粒度，精確稱取0.25 g靈芝粉及適量的纖維素酶，加入純化水在一定溫度水浴下酶解提取后，在沸水浴中滅酶4 min，抽濾得靈芝多糖提取液。

1.2.2多糖提取率的測定以葡萄糖作為標準品，采用苯酚-硫酸法測定總糖含量，并采用3，5-二硝基水楊酸法測定還原糖含量，最后根據下式計算靈芝多糖提取率。

多糖提取率=（總糖量-還原糖量）/供試樣品量×100%。

1.2.3響應面試驗設計綜合單因素影響多糖提取率的試驗結果，選擇提取溫度、酶量、提取時間3個因素，以靈芝多糖的提取率為響應值，根據Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理，采用響應面法在3因素3水平上對靈芝多糖的提取條件進行優化。

2結果與分析

在單因素試驗基礎上，表2中試驗1～12 為析因試驗，13～17 為中心試驗，17個試驗點分為析因點和零點，其中析因點為自變量取值在x1、x2、x3所構成的三維頂點，零點為區域的中心點，零點試驗重復5次，用以估計試驗誤差。對所得數據進行回歸分析，分析結果見表3。各因素經回歸擬合后，

響應面試驗回歸模型分析結果

變異源平方和自由度均方F值P值模型18.2992.037.870.006 3x13.3513.3512.990.008 7x22.6212.6210.160.015 3x36.8816.8826.660.001 3x1x20.4410.441.700.233 8x1x31.0811.084.170.080 6x2x30.2410.240.940.364 6x121.0711.074.130.081 7x222.2912.298.870.020 6x320.2810.281.080.334 2模型項1.8170.26失擬度1.3130.443.480.129 7純誤差0.5040.13總變異20.1016注：R2=0.910 1，P<0.05為顯著，P<0.01為極顯著。

得回歸方程為：y=10.33+0.65x1+0.57x2+0.93x3-0.33x1x2-0.52x1x3-0.25x2x3-0.50x12-0.74x22+0.26x32。

模型P=0.006 3<0.01，表明該響應面回歸模型達到極顯著水平；失擬度P=0.129 7>0.05，說明檢驗結果與模型計算結果沒有顯著差異。提取溫度、酶量、提取時間這3個因素的P值分別為0.008 7、0.015 3、0.001 3，均小于0.05，說明這3個因素均對靈芝多糖提取率有顯著影響。對各個因素之間的交互作用進行分析，x1x2、x1x3、x2x3的P值均大于 0.05，說明各個因素之間的交互影響較小。回歸方程的相關系數r=0.954 0，說明響應值（提取率）的變化有9540%來源于所選變量（即提取溫度、提取時間和酶量）。因此，回歸方程可以較好地描述各因素與響應值之間的真實關系，可以利用該回歸方程確定最佳提取工藝條件。

為進一步直觀說明提取溫度、酶量和提取時間之間的交

互作用及其對多糖提取率的影響，用Design-expert軟件對試驗數據進行分析，得出響應面和等高線圖，通過考察擬合響應面的形狀，分析提取溫度、酶量、提取時間對靈芝多糖提取率的影響。

多糖提取率在設定范圍內隨提取

時間延長而增大；而在設定的范圍內，多糖提取率隨酶量和提取溫度增加均是上升后達到一個平衡，即最大值。從經濟角度和提取的可行性考慮，將2.5 h定為最適提取時間，最佳提取酶量和提取溫度可以由上述方程求導得到，即靈芝多糖提取最佳工藝條件為提取溫度50.59 ℃、酶量1.80%、提取時間2.5 h，在該條件下由響應面模型預測的靈芝多糖提取率的理論值為11.55%。

為了驗證試驗的可靠性，采用最優提取條件浸提靈芝多糖，考慮到試驗操作的可行性，為方便實際操作，將條件修正為提取溫度51 ℃、酶量1.80%、提取時間2.5 h，在此條件下實際提取率11.25%，實際測定值比理論預測值（11.55%）低260%。由此可見，采用響應面分析法優化得到的浸提條件參數準確可靠，具有很好的實際應用價值。

3結論

在單因素試驗設計的基礎上，通過設計3因素3水平響應面分析法試驗，確定靈芝多糖的提取最佳工藝參數為提取溫度51 ℃、酶量1.80%、提取時間2.5 h，按照此工藝提取靈芝多糖的提取率較高，實際提取率可達11.25%。

參考文獻：

[1]張志軍，李淑芳，魏雪生，等. 靈芝多糖體外抗氧化活性的研究[J]. 化學與生物工程，2011，28（3）：63-65.

[2]黃智璇，歐陽蒲月.靈芝多糖降血糖作用的研究[J]. 食用菌，2009，31（1）：60-61.

[3]李麗，雷林生，余傳林，等. 荷S-180移植瘤小鼠血清干擾素 γ含量的變化及免疫調節藥物的干預作用[J]. 南方醫科大學學報，2008，28（1）：65-68.

[4]李建軍，雷林生，余傳林，等. 靈芝多糖抗腫瘤作用的免疫學相關性研究[J]. 中藥材，2007，30（1）：71-73.

[5]吳鋒，孟國梁，楊麗云，等. 靈芝多糖預防大鼠動脈粥樣硬化的實驗研究[J]. 南通大學學報：醫學版，2008，28（4）：251-252，255.

[6]李小平，陳錦屏. 油棗多糖的酶法提取及其對多糖分子量分布的影響[J]. 食品科學，2007，28（8）：191-194.

[7]王明艷，張小杰，王濤，等. 響應面法優化香椿葉多糖的提取條件[J]. 食品科學，2010，31（4）：106-110.任冰如，陳劍，呂寒，等. 紅鳳菜總黃酮的富集方法[J]. 江蘇農業科學，2014，42（6）：260-262.endprint

摘要：根據單因素試驗結果，選用提取時間、提取溫度、酶量3個反應因素作為研究對象，以多糖提取率為考察指標，通過響應面分析方法優化靈芝多糖的提取工藝條件。結果表明，最佳提取條件為提取溫度51 ℃、酶量180%、提取時間2.5 h。在最佳工藝條件下，多糖提取率可達11.25%。

關鍵詞：靈芝多糖；酶法提取；響應面分析

中圖分類號： R284.2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0258-02

收稿日期：2013-09-16

基金項目：江蘇農林職業技術學院科技項目（編號：2010c09）。

作者簡介：呂興萍（1981—），女，江蘇海安人，碩士，講師，主要從事中藥新劑型研究。E-mail：xingping8702007@sohu.com。靈芝（Ganoderma lucidum）是擔子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌赤芝和紫芝的總稱，具有扶正固本等功效。靈芝多糖是靈芝的主要活性成分，具有免疫調節、抗輻射、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老以及活血化瘀等廣泛的藥理活性[1-5]，因此靈芝多糖是目前靈芝研究的熱點之一。目前靈芝多糖的提取方法主要是傳統的水提醇沉法，此外還有膜分離法、酶解法、超聲法、微波法等。其中，酶解法通過酶解破壞細胞結構來強化有效成分的傳質過程，較大幅度提高多糖得率，不易破壞多糖的立體結構和生物活性[6]。響應面法以最經濟的方式、較少的試驗次數和較短的時間對所選的試驗參數進行全面研究[7]。本試驗擬采取酶解法提取靈芝多糖，以靈芝多糖提取率響應值為研究對象，應用響應面法對靈芝多糖的提取條件進行優化，以期得到靈芝多糖最佳提取工藝參數。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

HY-02型高速粉碎機（北京環亞天元機械技術有限公司），上海菁華754分光光度計，電子天平，HH-S型恒溫水浴鍋（江蘇金壇市金城國盛實驗儀器廠），SHZ-IIIB循環式多用真空泵（浙江省臨海市譚氏真空設備有限公司）。

靈芝子實體（江蘇農林職業技術學院食用菌研究所）；纖維素酶（活性≥400 U/mg）；濃硫酸、苯酚、無水葡萄糖、乙醇均為國產分析純。

1.2試驗方法

1.2.1靈芝多糖的提取將干燥的靈芝切片在高速粉碎機下粉碎至一定粒度，精確稱取0.25 g靈芝粉及適量的纖維素酶，加入純化水在一定溫度水浴下酶解提取后，在沸水浴中滅酶4 min，抽濾得靈芝多糖提取液。

1.2.2多糖提取率的測定以葡萄糖作為標準品，采用苯酚-硫酸法測定總糖含量，并采用3，5-二硝基水楊酸法測定還原糖含量，最后根據下式計算靈芝多糖提取率。

多糖提取率=（總糖量-還原糖量）/供試樣品量×100%。

1.2.3響應面試驗設計綜合單因素影響多糖提取率的試驗結果，選擇提取溫度、酶量、提取時間3個因素，以靈芝多糖的提取率為響應值，根據Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理，采用響應面法在3因素3水平上對靈芝多糖的提取條件進行優化。

2結果與分析

在單因素試驗基礎上，表2中試驗1～12 為析因試驗，13～17 為中心試驗，17個試驗點分為析因點和零點，其中析因點為自變量取值在x1、x2、x3所構成的三維頂點，零點為區域的中心點，零點試驗重復5次，用以估計試驗誤差。對所得數據進行回歸分析，分析結果見表3。各因素經回歸擬合后，

響應面試驗回歸模型分析結果

變異源平方和自由度均方F值P值模型18.2992.037.870.006 3x13.3513.3512.990.008 7x22.6212.6210.160.015 3x36.8816.8826.660.001 3x1x20.4410.441.700.233 8x1x31.0811.084.170.080 6x2x30.2410.240.940.364 6x121.0711.074.130.081 7x222.2912.298.870.020 6x320.2810.281.080.334 2模型項1.8170.26失擬度1.3130.443.480.129 7純誤差0.5040.13總變異20.1016注：R2=0.910 1，P<0.05為顯著，P<0.01為極顯著。

得回歸方程為：y=10.33+0.65x1+0.57x2+0.93x3-0.33x1x2-0.52x1x3-0.25x2x3-0.50x12-0.74x22+0.26x32。

模型P=0.006 3<0.01，表明該響應面回歸模型達到極顯著水平；失擬度P=0.129 7>0.05，說明檢驗結果與模型計算結果沒有顯著差異。提取溫度、酶量、提取時間這3個因素的P值分別為0.008 7、0.015 3、0.001 3，均小于0.05，說明這3個因素均對靈芝多糖提取率有顯著影響。對各個因素之間的交互作用進行分析，x1x2、x1x3、x2x3的P值均大于 0.05，說明各個因素之間的交互影響較小。回歸方程的相關系數r=0.954 0，說明響應值（提取率）的變化有9540%來源于所選變量（即提取溫度、提取時間和酶量）。因此，回歸方程可以較好地描述各因素與響應值之間的真實關系，可以利用該回歸方程確定最佳提取工藝條件。

為進一步直觀說明提取溫度、酶量和提取時間之間的交

互作用及其對多糖提取率的影響，用Design-expert軟件對試驗數據進行分析，得出響應面和等高線圖，通過考察擬合響應面的形狀，分析提取溫度、酶量、提取時間對靈芝多糖提取率的影響。

多糖提取率在設定范圍內隨提取

時間延長而增大；而在設定的范圍內，多糖提取率隨酶量和提取溫度增加均是上升后達到一個平衡，即最大值。從經濟角度和提取的可行性考慮，將2.5 h定為最適提取時間，最佳提取酶量和提取溫度可以由上述方程求導得到，即靈芝多糖提取最佳工藝條件為提取溫度50.59 ℃、酶量1.80%、提取時間2.5 h，在該條件下由響應面模型預測的靈芝多糖提取率的理論值為11.55%。

為了驗證試驗的可靠性，采用最優提取條件浸提靈芝多糖，考慮到試驗操作的可行性，為方便實際操作，將條件修正為提取溫度51 ℃、酶量1.80%、提取時間2.5 h，在此條件下實際提取率11.25%，實際測定值比理論預測值（11.55%）低260%。由此可見，采用響應面分析法優化得到的浸提條件參數準確可靠，具有很好的實際應用價值。

3結論

在單因素試驗設計的基礎上，通過設計3因素3水平響應面分析法試驗，確定靈芝多糖的提取最佳工藝參數為提取溫度51 ℃、酶量1.80%、提取時間2.5 h，按照此工藝提取靈芝多糖的提取率較高，實際提取率可達11.25%。

參考文獻：

[1]張志軍，李淑芳，魏雪生，等. 靈芝多糖體外抗氧化活性的研究[J]. 化學與生物工程，2011，28（3）：63-65.

[2]黃智璇，歐陽蒲月.靈芝多糖降血糖作用的研究[J]. 食用菌，2009，31（1）：60-61.

[3]李麗，雷林生，余傳林，等. 荷S-180移植瘤小鼠血清干擾素 γ含量的變化及免疫調節藥物的干預作用[J]. 南方醫科大學學報，2008，28（1）：65-68.

[4]李建軍，雷林生，余傳林，等. 靈芝多糖抗腫瘤作用的免疫學相關性研究[J]. 中藥材，2007，30（1）：71-73.

[5]吳鋒，孟國梁，楊麗云，等. 靈芝多糖預防大鼠動脈粥樣硬化的實驗研究[J]. 南通大學學報：醫學版，2008，28（4）：251-252，255.

[6]李小平，陳錦屏. 油棗多糖的酶法提取及其對多糖分子量分布的影響[J]. 食品科學，2007，28（8）：191-194.

[7]王明艷，張小杰，王濤，等. 響應面法優化香椿葉多糖的提取條件[J]. 食品科學，2010，31（4）：106-110.任冰如，陳劍，呂寒，等. 紅鳳菜總黃酮的富集方法[J]. 江蘇農業科學，2014，42（6）：260-262.endprint

摘要：根據單因素試驗結果，選用提取時間、提取溫度、酶量3個反應因素作為研究對象，以多糖提取率為考察指標，通過響應面分析方法優化靈芝多糖的提取工藝條件。結果表明，最佳提取條件為提取溫度51 ℃、酶量180%、提取時間2.5 h。在最佳工藝條件下，多糖提取率可達11.25%。

關鍵詞：靈芝多糖；酶法提取；響應面分析

中圖分類號： R284.2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0258-02

收稿日期：2013-09-16

基金項目：江蘇農林職業技術學院科技項目（編號：2010c09）。

作者簡介：呂興萍（1981—），女，江蘇海安人，碩士，講師，主要從事中藥新劑型研究。E-mail：xingping8702007@sohu.com。靈芝（Ganoderma lucidum）是擔子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌赤芝和紫芝的總稱，具有扶正固本等功效。靈芝多糖是靈芝的主要活性成分，具有免疫調節、抗輻射、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老以及活血化瘀等廣泛的藥理活性[1-5]，因此靈芝多糖是目前靈芝研究的熱點之一。目前靈芝多糖的提取方法主要是傳統的水提醇沉法，此外還有膜分離法、酶解法、超聲法、微波法等。其中，酶解法通過酶解破壞細胞結構來強化有效成分的傳質過程，較大幅度提高多糖得率，不易破壞多糖的立體結構和生物活性[6]。響應面法以最經濟的方式、較少的試驗次數和較短的時間對所選的試驗參數進行全面研究[7]。本試驗擬采取酶解法提取靈芝多糖，以靈芝多糖提取率響應值為研究對象，應用響應面法對靈芝多糖的提取條件進行優化，以期得到靈芝多糖最佳提取工藝參數。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

HY-02型高速粉碎機（北京環亞天元機械技術有限公司），上海菁華754分光光度計，電子天平，HH-S型恒溫水浴鍋（江蘇金壇市金城國盛實驗儀器廠），SHZ-IIIB循環式多用真空泵（浙江省臨海市譚氏真空設備有限公司）。

靈芝子實體（江蘇農林職業技術學院食用菌研究所）；纖維素酶（活性≥400 U/mg）；濃硫酸、苯酚、無水葡萄糖、乙醇均為國產分析純。

1.2試驗方法

1.2.1靈芝多糖的提取將干燥的靈芝切片在高速粉碎機下粉碎至一定粒度，精確稱取0.25 g靈芝粉及適量的纖維素酶，加入純化水在一定溫度水浴下酶解提取后，在沸水浴中滅酶4 min，抽濾得靈芝多糖提取液。

1.2.2多糖提取率的測定以葡萄糖作為標準品，采用苯酚-硫酸法測定總糖含量，并采用3，5-二硝基水楊酸法測定還原糖含量，最后根據下式計算靈芝多糖提取率。

多糖提取率=（總糖量-還原糖量）/供試樣品量×100%。

1.2.3響應面試驗設計綜合單因素影響多糖提取率的試驗結果，選擇提取溫度、酶量、提取時間3個因素，以靈芝多糖的提取率為響應值，根據Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理，采用響應面法在3因素3水平上對靈芝多糖的提取條件進行優化。

2結果與分析

在單因素試驗基礎上，表2中試驗1～12 為析因試驗，13～17 為中心試驗，17個試驗點分為析因點和零點，其中析因點為自變量取值在x1、x2、x3所構成的三維頂點，零點為區域的中心點，零點試驗重復5次，用以估計試驗誤差。對所得數據進行回歸分析，分析結果見表3。各因素經回歸擬合后，

響應面試驗回歸模型分析結果

變異源平方和自由度均方F值P值模型18.2992.037.870.006 3x13.3513.3512.990.008 7x22.6212.6210.160.015 3x36.8816.8826.660.001 3x1x20.4410.441.700.233 8x1x31.0811.084.170.080 6x2x30.2410.240.940.364 6x121.0711.074.130.081 7x222.2912.298.870.020 6x320.2810.281.080.334 2模型項1.8170.26失擬度1.3130.443.480.129 7純誤差0.5040.13總變異20.1016注：R2=0.910 1，P<0.05為顯著，P<0.01為極顯著。

得回歸方程為：y=10.33+0.65x1+0.57x2+0.93x3-0.33x1x2-0.52x1x3-0.25x2x3-0.50x12-0.74x22+0.26x32。

模型P=0.006 3<0.01，表明該響應面回歸模型達到極顯著水平；失擬度P=0.129 7>0.05，說明檢驗結果與模型計算結果沒有顯著差異。提取溫度、酶量、提取時間這3個因素的P值分別為0.008 7、0.015 3、0.001 3，均小于0.05，說明這3個因素均對靈芝多糖提取率有顯著影響。對各個因素之間的交互作用進行分析，x1x2、x1x3、x2x3的P值均大于 0.05，說明各個因素之間的交互影響較小。回歸方程的相關系數r=0.954 0，說明響應值（提取率）的變化有9540%來源于所選變量（即提取溫度、提取時間和酶量）。因此，回歸方程可以較好地描述各因素與響應值之間的真實關系，可以利用該回歸方程確定最佳提取工藝條件。

為進一步直觀說明提取溫度、酶量和提取時間之間的交

互作用及其對多糖提取率的影響，用Design-expert軟件對試驗數據進行分析，得出響應面和等高線圖，通過考察擬合響應面的形狀，分析提取溫度、酶量、提取時間對靈芝多糖提取率的影響。

多糖提取率在設定范圍內隨提取

時間延長而增大；而在設定的范圍內，多糖提取率隨酶量和提取溫度增加均是上升后達到一個平衡，即最大值。從經濟角度和提取的可行性考慮，將2.5 h定為最適提取時間，最佳提取酶量和提取溫度可以由上述方程求導得到，即靈芝多糖提取最佳工藝條件為提取溫度50.59 ℃、酶量1.80%、提取時間2.5 h，在該條件下由響應面模型預測的靈芝多糖提取率的理論值為11.55%。

為了驗證試驗的可靠性，采用最優提取條件浸提靈芝多糖，考慮到試驗操作的可行性，為方便實際操作，將條件修正為提取溫度51 ℃、酶量1.80%、提取時間2.5 h，在此條件下實際提取率11.25%，實際測定值比理論預測值（11.55%）低260%。由此可見，采用響應面分析法優化得到的浸提條件參數準確可靠，具有很好的實際應用價值。

3結論

在單因素試驗設計的基礎上，通過設計3因素3水平響應面分析法試驗，確定靈芝多糖的提取最佳工藝參數為提取溫度51 ℃、酶量1.80%、提取時間2.5 h，按照此工藝提取靈芝多糖的提取率較高，實際提取率可達11.25%。

參考文獻：

[1]張志軍，李淑芳，魏雪生，等. 靈芝多糖體外抗氧化活性的研究[J]. 化學與生物工程，2011，28（3）：63-65.

[2]黃智璇，歐陽蒲月.靈芝多糖降血糖作用的研究[J]. 食用菌，2009，31（1）：60-61.

[3]李麗，雷林生，余傳林，等. 荷S-180移植瘤小鼠血清干擾素 γ含量的變化及免疫調節藥物的干預作用[J]. 南方醫科大學學報，2008，28（1）：65-68.

[4]李建軍，雷林生，余傳林，等. 靈芝多糖抗腫瘤作用的免疫學相關性研究[J]. 中藥材，2007，30（1）：71-73.

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[6]李小平，陳錦屏. 油棗多糖的酶法提取及其對多糖分子量分布的影響[J]. 食品科學，2007，28（8）：191-194.

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