彗星試驗檢測哺乳動物細胞DNA損傷樣品制備方法

王楠+薛永來+杜道林

摘要：彗星試驗（comet assay）是近年來逐步發展起來的1種檢測單細胞水平DNA損傷的新技術，該技術已被廣泛應用于遺傳毒理學、，輻射生物學、環境生態學等領域。在堿性SCGE基礎上，對哺乳動物細胞SCGE檢測樣品制備的方法進行了改進與優化，使改進后的方法更加快速簡便、易于推廣。

關鍵詞：彗星實驗（單細胞凝膠電泳）；DNA損傷；HepG2細胞；電泳圖像質量

中圖分類號： Q291；X503.22文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0041-02

收稿日期：2013-10-04

基金項目：國家自然科學基金（編號：31100379）；江蘇省高校自然科學基金（編號：11KJB610001）；中國博士后科學基金（編號：20100470062）；江蘇省博士后基金（編號：1001024C）。

作者簡介：王楠（1984—），男，山西大同人，碩士，從事環境毒理學研究。E-mail：nan.wuhan.2006@163.com

通信作者：杜道林，博士，教授，從事生態學研究。E-mail：ddl@ujs.edu.cn。DNA存儲著生物體賴以生存繁衍的遺傳信息，細胞DNA損傷是細胞生物學領域的研究熱點之一。當細胞受到損傷時，其DNA雙鏈會發生斷裂，斷裂過程中會發生特異性級聯生化反應，依賴Ca2+、Mg2+的核酸內切酶被激活，優先作用于連接DNA的核小體間區域，將DNA鏈切割成180～200 bp或其倍數的片段，在彗星電泳中發生斷裂的DNA遷移速度與遷移距離均數倍于正常細胞的核DNA，呈現脫離細胞核的“彗星”狀，據此可將DNA受損細胞與正常細胞區分開[1]。彗星試驗（comet assay）也被稱作單細胞凝膠電泳（SCGE），是1種在單細胞水平上檢測真核細胞DNA損傷的方法。通過測定細胞電泳時彗星出現率、彗尾DNA含量百分比、彗尾長度等指標，即可對細胞藥物引起細胞DNA損傷進行全面評價[2]。1993年，Olive等首次將彗星試驗應用于細胞凋亡檢測[3]。真核細胞的DNA分子量較大，DNA呈負超螺旋結構附著在核基質中，采用瓊脂糖凝膠將細胞包埋在細胞裂解液下，細胞膜、核膜等被破壞，細胞內的RNA、蛋白質等其他成分進入凝膠，繼而擴散到裂解液中，核DNA仍然保持纏繞狀，附著在剩余的核骨架上，并留在原位。在強堿（pH值為13）電泳液中電泳時，若細胞未受到損傷，核DNA分子量大且未發生斷裂，仍停留在核基質中，經熒光染料染色后，核在原位形成1個明亮的頭部，無拖尾現象；若細胞受損，會出現DNA單鏈或雙鏈斷裂，強堿環境下DNA解旋為單鏈，DNA斷裂片段進入凝膠中，在電場力作用下，斷裂的DNA片段因攜帶負電荷脫離核DNA向陽極移動，DNA碎片形成彗星狀尾部，即可形成彗星圖像。彗星電泳檢測技術具有所需樣品量少、適用于任何真核細胞、靈敏度高、細胞不需處于有絲分裂期、無需放射性標記等優點，已被廣泛應用于真核細胞DNA損傷及修復、藥物篩選、腫瘤發病機制與治療等研究。目前，用于彗星電泳檢測分析的樣品制備過程主要包括樣品凝膠制備、細胞裂解、解旋與電泳、中和洗滌、熒光染色、采用彗星凝膠電泳攝像系統拍攝熒光照片等步驟。通常，熒光染色步驟中所使用的熒光染料為溴化乙錠（ethidium bromide，EB），EB是1種強誘變劑，容易揮發，對操作人員的健康造成威脅。使用后的染色玻片直接扔進垃圾箱可能會對周圍環境造成潛在危害。此外，目前用于彗星電泳分析所制備的凝膠玻片通常要鋪3層凝膠，且在后續裂解、電泳及漂洗過程中，凝膠極易脫離載玻片，造成制膠失敗，影響彗星電泳技術的推廣與應用。咪唑類離子液體因具有不揮發、不易燃、導電性強、性質穩定、對許多無機鹽及有機物有良好的溶解性等物化性質，使得其在化學合成、催化、電化學、分析化學等領域得到了廣泛應用[4]。然而，研究表明，咪唑類離子液體不僅對細菌及真菌的生長具有很強的抑制作用，對人類上皮細胞也具有較強的細胞毒性，且細胞毒性隨著離子液體烷基側鏈長度的增加而增加[5-8]。本研究采用基于人肝臟腫瘤細胞系HepG2的彗星試驗檢測了離子液體1-丁基-3-甲基溴代鹽（[C8mim]Br）的DNA損傷作用，旨在為評價咪唑類離子液體的遺傳毒性提供依據。

1材料與方法

1.1材料

[C8mim]Br（上海成捷化學有限公司），純度>99%，[C8mim]Br用0.01 mol/L磷酸緩沖溶液（PBS）溶解，貯存液濃度為10 mol/L，4 ℃保存，臨用時用10%胎牛血清培養液稀釋至所需濃度；DMEM培養基、正常熔點瓊脂糖（NMA）、低熔點瓊脂糖（LMA）、Gel Red核酸凝膠染料均為美國Gibco公司產品；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），-20 ℃ 保存，臨用時經56 ℃水浴滅活 30 min；胰蛋白酶（美國Amresco公司）；其他試劑均為分析純。

1.2主要儀器

CO2培養箱（美國Heal Force公司）、TE601-L電子天平、BS124S分析天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）、JM250水平電泳儀（大連捷邁科技發展有限公司）、Ti-E2000型倒置熒光顯微鏡（Nikon公司）、超凈工作臺（蘇州市新區楓橋凈化設備廠）。

1.3方法

1.3.1細胞培養HepG2細胞來源于American Type Culture Collection（ATCC HB-8065），購自江蘇大學藥學院。細胞貼壁生長于DMEM培養液中，培養液中加入10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL鏈霉素，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的二氧化碳培養箱中培養，每天換液，每隔2～3 d傳代。

1.3.2細胞處理取處于對數生長期的細胞，用0.25%胰蛋白酶消化液收獲，調節細胞濃度為1×106個/mL，接種于6孔板中，培養24 h至80%融合度，分別加入[C8mim]Br至終濃度為1、2 mmol/L，37 ℃下作用24 h，以0.1 mmol/L H2O2作為陽性對照，作用1 h。以PBS為陰性對照。細胞染毒后，用PBS洗滌2次，800 r/min離心5 min收集細胞，將細胞重懸于1 mL預冷PBS中，用臺盼藍法測定細胞存活率>95%，調整細胞濃度為1×105～5×105個/mL備用。

1.3.3凝膠制備第1層膠制備：將100 μL 1%正常熔點的瓊脂糖滴至磨砂邊載玻片上，用另一塊玻片均勻推開，蓋上蓋玻片后迅速置于4 ℃冰箱中固化10 min。第2層膠制備：將 60 μL 待測細胞懸液與0.78%低熔點瓊脂糖在42 ℃水浴中按1 ∶2（體積比）混合，滴80 μL上述混合液至第1層膠上，蓋上蓋玻片置于4 ℃冰箱中固化10 min。得到鋪有2層凝膠的玻片。

1.3.4細胞裂解用彎頭鑷子小心平移走蓋玻片，將鋪有2層凝膠的玻片浸入裝有預冷細胞裂解液（2.5 mol/L NaCl、100 mmol/L Na2EDTA、10 mmol/L pH值為10的Tris緩沖液、1%肌氨酸鈉、1% Triton X-100、10% DMSO）的平皿中，4 ℃避光裂解1 h。取出載玻片，用蒸餾水輕輕漂洗2次。

1.3.5DNA解鏈與電泳將上述細胞裂解后的玻片置于水平電泳槽正極端，緩緩倒入新配制的電泳緩沖液（1 mmol/L Na2EDTA，300 mmol/L NaOH，pH 值為13），約覆蓋過玻片膠面0.3 cm左右，避光靜置30 min，電泳電壓為25 V，電流 300 mA 電泳20 min。

1.3.6中和脫水將電泳后的玻片浸入0.4 mmol/L pH值為7.5 的Tris-HCl中和緩沖液中浸洗3遍，用0.01 mol/L PBS洗凈，玻片依次經體積分數為50%、75%、100%的乙醇梯度脫水，每次2 min，室溫下晾干。

1.3.7熒光染色在脫水后的玻片上滴20 μL Gel Red核酸凝膠染料，用蓋玻片輕輕推開Gel Red染料，使Gel Red在瓊脂糖表面均勻鋪開，蓋上蓋玻片，避光染色10 min。

1.3.8 鏡檢拍照將制得的樣品玻片與空白對照玻片置于倒置熒光顯微鏡下，激發波長為515～560 nm，用100倍物鏡觀察，每個樣本隨機選擇10～20個細胞拍照攝取圖像。每個樣品玻片隨機選取10個拖尾細胞，采用CASP彗星分析軟件測量彗星尾長（tail length）、彗星尾力矩（tail moment）、彗星尾DNA百分含量。

1.3.9數據分析采用Origin7.5軟件分析數據。

2結果與分析

，[C8mim]Br與HepG2細胞接觸24 h，在熒光顯微鏡下，經Gel Red 染色的細胞DNA呈橘紅色，未發生斷裂的DNA只有1個完整的頭部，斷裂的DNA形成拖尾，HepG2細胞呈現“彗星”樣細胞，，隨著[C8mim]Br劑量的增加，拖尾現象更加明顯，表明細胞DNA損傷程度加重。由表1可知，咪唑類離子液體[C8mim]Br可誘發HepG2細胞DNA原始損傷。

表1不同濃度[C8mim]Br 下HepG2細胞DNA損傷程度

受試物濃度（mmol/L）彗尾DNA含量（%）彗星尾長（μm）彗星尾力矩（μm）PBS 2.2±0.313.1±4.90.4±0.1H2O20.163.0±9.3**145.2±20.0**81.6±11.9**[C8mim]Br1.022.7±3.8**79.0±12.5**25.4±3.9**2.038.2±1.8**105.3±14.8**47.3±3.8**注：同列數據后“**”表示差異極顯著。

3結論與討論

彗星試驗是一種靈敏、可靠的檢測細胞核DNA損傷的技術，可以檢測DNA雙鏈斷裂、單鏈斷裂、堿基不穩定位點等多種類型損傷，是評價外來化合物遺傳毒性的有效手段。近年來，研究人員采用HepG2細胞彗星試驗對消毒劑處理飲用水的有機提取物以及農藥等的遺傳毒性進行了研究[9-10]。本研究所涉及的凝膠制片步驟只要鋪2層膠，與傳統的彗星試驗樣品玻片要鋪3層膠的“三明治”鋪膠工藝相比，具有可操作性強、不易脫膠、易于推廣等優點。同時，采用梯度乙醇對樣本進行脫水，可使樣本脫水更加徹底，分析彗星電泳圖像時，可減弱熒光衰減程度，提高圖像質量。此外，與傳統熒光染料相比，Gel Red核酸凝膠染料低毒、穩定，對哺乳動物細胞毒性小，且廢棄物不會造成環境污染。

參考文獻：

[1]Dizdaroglu M，Jaruga P，Birincioglu M，et al. Free radical-induced damage to DNA：mechanisms and measurement[J]. Free Radical Biology and Medicine，2002，32（11）：1102-1115.

[2]Ostling O，Johanson K J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalion cells[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，1984，123（1）：291-298.

[3]Olive P L，Banáth J P，Durand R E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the “comet” assay[J]. Radiation Research，1990，122（1）：86-94.

[4]肖小華，劉淑娟，劉霞，等. 離子液體及其在分離分析中的應用進展[J]. 分析化學，2005，33（4）：569-574.

[5]Babalola G O. Anti-bacterial activity of synthetic N-heterocyclic oxidizing compounds[J]. Letters in Applied Microbiology，1998，26（1）：43-46.

[6]Li G J，Shen J R，Zhu Y L. Study of pyridinium-type functional polymers. Ⅱ. Antibacterial activity of soluble pyridinium-type polymers[J]. Journal of Applied Polymer Science，1998，67（10）：1761-1768.

[7]Kelman D，Kashman Y，Rosenberg E，et al. Antimicrobial activity of the reef sponge Amphimedon viridis from the Red Sea：evidence for selective toxicity[J]. Aquatic Microbial Ecology，2001，24（1）：9-16.

[8]Pernak J，Chwaa P. Synthesis and anti-microbial activities of choline-like quaternary ammonium chlorides[J]. European Journal of Medicinal Chemistry，2003，38（11/12）：1035-1042.

[9]杜海榮，曹賢文，張榮，等. 不同消毒劑處理飲用水的有機提取物對HepG2細胞DNA的損傷作用[J]. 環境與職業醫學，2008，25（6）：557-560.

[10]周炯林，連勇，彭雙清，等. 敵敵畏、樂果和馬拉硫磷誘導HepG2細胞DNA損傷的實驗研究[J]. 癌變·畸變·突變，2010，22（2）：126-129.趙瀟. 不同水稻受體材料對潔凈DNA轉化效率的影響[J]. 江蘇農業科學，2014，42（6）：43-47.

1.3.3凝膠制備第1層膠制備：將100 μL 1%正常熔點的瓊脂糖滴至磨砂邊載玻片上，用另一塊玻片均勻推開，蓋上蓋玻片后迅速置于4 ℃冰箱中固化10 min。第2層膠制備：將 60 μL 待測細胞懸液與0.78%低熔點瓊脂糖在42 ℃水浴中按1 ∶2（體積比）混合，滴80 μL上述混合液至第1層膠上，蓋上蓋玻片置于4 ℃冰箱中固化10 min。得到鋪有2層凝膠的玻片。

1.3.4細胞裂解用彎頭鑷子小心平移走蓋玻片，將鋪有2層凝膠的玻片浸入裝有預冷細胞裂解液（2.5 mol/L NaCl、100 mmol/L Na2EDTA、10 mmol/L pH值為10的Tris緩沖液、1%肌氨酸鈉、1% Triton X-100、10% DMSO）的平皿中，4 ℃避光裂解1 h。取出載玻片，用蒸餾水輕輕漂洗2次。

1.3.5DNA解鏈與電泳將上述細胞裂解后的玻片置于水平電泳槽正極端，緩緩倒入新配制的電泳緩沖液（1 mmol/L Na2EDTA，300 mmol/L NaOH，pH 值為13），約覆蓋過玻片膠面0.3 cm左右，避光靜置30 min，電泳電壓為25 V，電流 300 mA 電泳20 min。

1.3.6中和脫水將電泳后的玻片浸入0.4 mmol/L pH值為7.5 的Tris-HCl中和緩沖液中浸洗3遍，用0.01 mol/L PBS洗凈，玻片依次經體積分數為50%、75%、100%的乙醇梯度脫水，每次2 min，室溫下晾干。

1.3.7熒光染色在脫水后的玻片上滴20 μL Gel Red核酸凝膠染料，用蓋玻片輕輕推開Gel Red染料，使Gel Red在瓊脂糖表面均勻鋪開，蓋上蓋玻片，避光染色10 min。

1.3.8 鏡檢拍照將制得的樣品玻片與空白對照玻片置于倒置熒光顯微鏡下，激發波長為515～560 nm，用100倍物鏡觀察，每個樣本隨機選擇10～20個細胞拍照攝取圖像。每個樣品玻片隨機選取10個拖尾細胞，采用CASP彗星分析軟件測量彗星尾長（tail length）、彗星尾力矩（tail moment）、彗星尾DNA百分含量。

1.3.9數據分析采用Origin7.5軟件分析數據。

2結果與分析

，[C8mim]Br與HepG2細胞接觸24 h，在熒光顯微鏡下，經Gel Red 染色的細胞DNA呈橘紅色，未發生斷裂的DNA只有1個完整的頭部，斷裂的DNA形成拖尾，HepG2細胞呈現“彗星”樣細胞，，隨著[C8mim]Br劑量的增加，拖尾現象更加明顯，表明細胞DNA損傷程度加重。由表1可知，咪唑類離子液體[C8mim]Br可誘發HepG2細胞DNA原始損傷。

表1不同濃度[C8mim]Br 下HepG2細胞DNA損傷程度

受試物濃度（mmol/L）彗尾DNA含量（%）彗星尾長（μm）彗星尾力矩（μm）PBS 2.2±0.313.1±4.90.4±0.1H2O20.163.0±9.3**145.2±20.0**81.6±11.9**[C8mim]Br1.022.7±3.8**79.0±12.5**25.4±3.9**2.038.2±1.8**105.3±14.8**47.3±3.8**注：同列數據后“**”表示差異極顯著。

3結論與討論

彗星試驗是一種靈敏、可靠的檢測細胞核DNA損傷的技術，可以檢測DNA雙鏈斷裂、單鏈斷裂、堿基不穩定位點等多種類型損傷，是評價外來化合物遺傳毒性的有效手段。近年來，研究人員采用HepG2細胞彗星試驗對消毒劑處理飲用水的有機提取物以及農藥等的遺傳毒性進行了研究[9-10]。本研究所涉及的凝膠制片步驟只要鋪2層膠，與傳統的彗星試驗樣品玻片要鋪3層膠的“三明治”鋪膠工藝相比，具有可操作性強、不易脫膠、易于推廣等優點。同時，采用梯度乙醇對樣本進行脫水，可使樣本脫水更加徹底，分析彗星電泳圖像時，可減弱熒光衰減程度，提高圖像質量。此外，與傳統熒光染料相比，Gel Red核酸凝膠染料低毒、穩定，對哺乳動物細胞毒性小，且廢棄物不會造成環境污染。

參考文獻：

[1]Dizdaroglu M，Jaruga P，Birincioglu M，et al. Free radical-induced damage to DNA：mechanisms and measurement[J]. Free Radical Biology and Medicine，2002，32（11）：1102-1115.

[2]Ostling O，Johanson K J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalion cells[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，1984，123（1）：291-298.

[3]Olive P L，Banáth J P，Durand R E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the “comet” assay[J]. Radiation Research，1990，122（1）：86-94.

[4]肖小華，劉淑娟，劉霞，等. 離子液體及其在分離分析中的應用進展[J]. 分析化學，2005，33（4）：569-574.

[5]Babalola G O. Anti-bacterial activity of synthetic N-heterocyclic oxidizing compounds[J]. Letters in Applied Microbiology，1998，26（1）：43-46.

[6]Li G J，Shen J R，Zhu Y L. Study of pyridinium-type functional polymers. Ⅱ. Antibacterial activity of soluble pyridinium-type polymers[J]. Journal of Applied Polymer Science，1998，67（10）：1761-1768.

[7]Kelman D，Kashman Y，Rosenberg E，et al. Antimicrobial activity of the reef sponge Amphimedon viridis from the Red Sea：evidence for selective toxicity[J]. Aquatic Microbial Ecology，2001，24（1）：9-16.

[8]Pernak J，Chwaa P. Synthesis and anti-microbial activities of choline-like quaternary ammonium chlorides[J]. European Journal of Medicinal Chemistry，2003，38（11/12）：1035-1042.

[9]杜海榮，曹賢文，張榮，等. 不同消毒劑處理飲用水的有機提取物對HepG2細胞DNA的損傷作用[J]. 環境與職業醫學，2008，25（6）：557-560.

[10]周炯林，連勇，彭雙清，等. 敵敵畏、樂果和馬拉硫磷誘導HepG2細胞DNA損傷的實驗研究[J]. 癌變·畸變·突變，2010，22（2）：126-129.趙瀟. 不同水稻受體材料對潔凈DNA轉化效率的影響[J]. 江蘇農業科學，2014，42（6）：43-47.

1.3.3凝膠制備第1層膠制備：將100 μL 1%正常熔點的瓊脂糖滴至磨砂邊載玻片上，用另一塊玻片均勻推開，蓋上蓋玻片后迅速置于4 ℃冰箱中固化10 min。第2層膠制備：將 60 μL 待測細胞懸液與0.78%低熔點瓊脂糖在42 ℃水浴中按1 ∶2（體積比）混合，滴80 μL上述混合液至第1層膠上，蓋上蓋玻片置于4 ℃冰箱中固化10 min。得到鋪有2層凝膠的玻片。

1.3.4細胞裂解用彎頭鑷子小心平移走蓋玻片，將鋪有2層凝膠的玻片浸入裝有預冷細胞裂解液（2.5 mol/L NaCl、100 mmol/L Na2EDTA、10 mmol/L pH值為10的Tris緩沖液、1%肌氨酸鈉、1% Triton X-100、10% DMSO）的平皿中，4 ℃避光裂解1 h。取出載玻片，用蒸餾水輕輕漂洗2次。

1.3.5DNA解鏈與電泳將上述細胞裂解后的玻片置于水平電泳槽正極端，緩緩倒入新配制的電泳緩沖液（1 mmol/L Na2EDTA，300 mmol/L NaOH，pH 值為13），約覆蓋過玻片膠面0.3 cm左右，避光靜置30 min，電泳電壓為25 V，電流 300 mA 電泳20 min。

1.3.6中和脫水將電泳后的玻片浸入0.4 mmol/L pH值為7.5 的Tris-HCl中和緩沖液中浸洗3遍，用0.01 mol/L PBS洗凈，玻片依次經體積分數為50%、75%、100%的乙醇梯度脫水，每次2 min，室溫下晾干。

1.3.7熒光染色在脫水后的玻片上滴20 μL Gel Red核酸凝膠染料，用蓋玻片輕輕推開Gel Red染料，使Gel Red在瓊脂糖表面均勻鋪開，蓋上蓋玻片，避光染色10 min。

1.3.8 鏡檢拍照將制得的樣品玻片與空白對照玻片置于倒置熒光顯微鏡下，激發波長為515～560 nm，用100倍物鏡觀察，每個樣本隨機選擇10～20個細胞拍照攝取圖像。每個樣品玻片隨機選取10個拖尾細胞，采用CASP彗星分析軟件測量彗星尾長（tail length）、彗星尾力矩（tail moment）、彗星尾DNA百分含量。

1.3.9數據分析采用Origin7.5軟件分析數據。

2結果與分析

，[C8mim]Br與HepG2細胞接觸24 h，在熒光顯微鏡下，經Gel Red 染色的細胞DNA呈橘紅色，未發生斷裂的DNA只有1個完整的頭部，斷裂的DNA形成拖尾，HepG2細胞呈現“彗星”樣細胞，，隨著[C8mim]Br劑量的增加，拖尾現象更加明顯，表明細胞DNA損傷程度加重。由表1可知，咪唑類離子液體[C8mim]Br可誘發HepG2細胞DNA原始損傷。

表1不同濃度[C8mim]Br 下HepG2細胞DNA損傷程度

受試物濃度（mmol/L）彗尾DNA含量（%）彗星尾長（μm）彗星尾力矩（μm）PBS 2.2±0.313.1±4.90.4±0.1H2O20.163.0±9.3**145.2±20.0**81.6±11.9**[C8mim]Br1.022.7±3.8**79.0±12.5**25.4±3.9**2.038.2±1.8**105.3±14.8**47.3±3.8**注：同列數據后“**”表示差異極顯著。

3結論與討論

彗星試驗是一種靈敏、可靠的檢測細胞核DNA損傷的技術，可以檢測DNA雙鏈斷裂、單鏈斷裂、堿基不穩定位點等多種類型損傷，是評價外來化合物遺傳毒性的有效手段。近年來，研究人員采用HepG2細胞彗星試驗對消毒劑處理飲用水的有機提取物以及農藥等的遺傳毒性進行了研究[9-10]。本研究所涉及的凝膠制片步驟只要鋪2層膠，與傳統的彗星試驗樣品玻片要鋪3層膠的“三明治”鋪膠工藝相比，具有可操作性強、不易脫膠、易于推廣等優點。同時，采用梯度乙醇對樣本進行脫水，可使樣本脫水更加徹底，分析彗星電泳圖像時，可減弱熒光衰減程度，提高圖像質量。此外，與傳統熒光染料相比，Gel Red核酸凝膠染料低毒、穩定，對哺乳動物細胞毒性小，且廢棄物不會造成環境污染。

參考文獻：

[1]Dizdaroglu M，Jaruga P，Birincioglu M，et al. Free radical-induced damage to DNA：mechanisms and measurement[J]. Free Radical Biology and Medicine，2002，32（11）：1102-1115.

[2]Ostling O，Johanson K J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalion cells[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，1984，123（1）：291-298.

[3]Olive P L，Banáth J P，Durand R E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the “comet” assay[J]. Radiation Research，1990，122（1）：86-94.

[4]肖小華，劉淑娟，劉霞，等. 離子液體及其在分離分析中的應用進展[J]. 分析化學，2005，33（4）：569-574.

[5]Babalola G O. Anti-bacterial activity of synthetic N-heterocyclic oxidizing compounds[J]. Letters in Applied Microbiology，1998，26（1）：43-46.

[6]Li G J，Shen J R，Zhu Y L. Study of pyridinium-type functional polymers. Ⅱ. Antibacterial activity of soluble pyridinium-type polymers[J]. Journal of Applied Polymer Science，1998，67（10）：1761-1768.

[7]Kelman D，Kashman Y，Rosenberg E，et al. Antimicrobial activity of the reef sponge Amphimedon viridis from the Red Sea：evidence for selective toxicity[J]. Aquatic Microbial Ecology，2001，24（1）：9-16.

[8]Pernak J，Chwaa P. Synthesis and anti-microbial activities of choline-like quaternary ammonium chlorides[J]. European Journal of Medicinal Chemistry，2003，38（11/12）：1035-1042.

[9]杜海榮，曹賢文，張榮，等. 不同消毒劑處理飲用水的有機提取物對HepG2細胞DNA的損傷作用[J]. 環境與職業醫學，2008，25（6）：557-560.

[10]周炯林，連勇，彭雙清，等. 敵敵畏、樂果和馬拉硫磷誘導HepG2細胞DNA損傷的實驗研究[J]. 癌變·畸變·突變，2010，22（2）：126-129.趙瀟. 不同水稻受體材料對潔凈DNA轉化效率的影響[J]. 江蘇農業科學，2014，42（6）：43-47.