團(tuán)頭魴黑素皮質(zhì)素受體2基因克隆、組織分布和應(yīng)激后的表達(dá)分析

2014-08-12 00:49:03董晶晶薛春雨習(xí)丙文等

江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年6期

董晶晶+薛春雨+習(xí)丙文+等

摘要：在神經(jīng)內(nèi)分泌下丘腦-垂體-腎間組織軸調(diào)控中，黑素皮質(zhì)素受體2（MC2R）與垂體釋放的促腎上腺皮質(zhì)激素結(jié)合而激活相應(yīng)的cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，對魚類的應(yīng)激反應(yīng)調(diào)控具有重要的作用。本研究通過PCR、RACE技術(shù)克隆獲得團(tuán)頭魴MC2R mRNA序列，并通過實時定量PCR分析了團(tuán)頭魴MC2R組織分布情況及捕撈脅迫后的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，獲得的MC2R mRNA序列開放閱讀框為915 bp，編碼304個氨基酸。序列同源性及系統(tǒng)育分析顯示，團(tuán)頭魴MC2R氨基酸序列與鯉科魚類的MC2R聚為一支，與金魚（Carassius auratus）MC2R的氨基酸序列同源性最高（87%）。組織分布結(jié)果表明，頭腎中MC2R的表達(dá)量最高，脾臟、精巢和腦中有相對較高的表達(dá)量，中腎、肝、腸和肌肉等MC2R的表達(dá)量相對較低。經(jīng)捕撈出水體60 s的急性應(yīng)激處理后，皮質(zhì)醇在4 h時顯著升高，24 h時表現(xiàn)出下降的趨勢；MC2R基因表達(dá)量在頭腎中變化不顯著，然而脾、腦和精巢中MC2R 在4 h時表達(dá)量相對于1 h則呈現(xiàn)出顯著的下降。通過對團(tuán)頭魴應(yīng)激后主要調(diào)控因子變化規(guī)律的研究，可為魚類應(yīng)激后調(diào)控措施的實施提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：團(tuán)頭魴；MC2R基因；皮質(zhì)醇；克隆；組織表達(dá)；應(yīng)激

中圖分類號： S917文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0020-07

收稿日期：2014-03-11

基金項目：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金（編號：CARS-46-10）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金（編號：2013JBFM10）。

作者簡介：董晶晶（1989—），女，河南周口人，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)動物營養(yǎng)與疾病防控的研究。E-mail：jingzsmx@163.com。

通信作者：謝駿，研究員，主要從事池塘微生態(tài)學(xué)、水產(chǎn)動物的應(yīng)激機(jī)制、細(xì)菌性病害生態(tài)防控技術(shù)的研究。E-mail：xiej@ffrc.cn。團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala），又稱武昌魚，隸屬于鯉形目（Cypriniformes）鯉科（Cyprinidae）鳊亞科（Abramidinae）魴屬（Megalobrama），是中國主要的淡水養(yǎng)殖品種之一。但團(tuán)頭魴魚體應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)，抗應(yīng)激能力低下，在拉網(wǎng)賣魚以及運輸過程中魚體由于應(yīng)激經(jīng)常出現(xiàn)“發(fā)毛發(fā)紅”，體表黏液減少或無黏液等現(xiàn)象，有時甚至導(dǎo)致魚體死亡，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖經(jīng)濟(jì)效益。魚類應(yīng)激反應(yīng)與其他脊椎動物類似，受下丘腦-垂體-腎間組織軸（HPI）的調(diào)控，在應(yīng)激源刺激后，下丘腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)釋放促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（corticotrophin-releasing hormone，CRH）作用于有促皮質(zhì)激素細(xì)胞分布的垂體前外側(cè)部，由促皮質(zhì)激素細(xì)胞中的阿片-促黑素細(xì)胞皮質(zhì)素原（proopiomelanocortin，POMC）前體肽經(jīng)加工處理生成促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH），進(jìn)而調(diào)控魚類重要皮質(zhì)激素——皮質(zhì)醇的合成，皮質(zhì)醇釋放到血液中，調(diào)節(jié)呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、能量代謝系統(tǒng)等相應(yīng)組織器官中的反應(yīng)變化[1-3]。

黑素皮質(zhì)素受體2（melanocortin 2 receptor，MC2R）是一種具有7個跨膜α螺旋結(jié)構(gòu)的G蛋白偶聯(lián)受體，在ACTH刺激皮質(zhì)醇合成分泌的過程中，MC2R與ACTH特異性結(jié)合，使得相應(yīng)的cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活，對脊椎動物皮質(zhì)醇合成和釋放的調(diào)控具有重要意義。MC2R在鼠的腎上腺發(fā)育以及類固醇合成中發(fā)揮著不可替代的作用，鼠MC2R的失活突變，使得高濃度ACTH也不能刺激皮質(zhì)醇的合成，甚至對ACTH刺激不能產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)[4]。

目前MC2R的激活及其配體結(jié)合能力在包括魚類等多種脊椎動物中得到了廣泛的研究[5-8]。研究發(fā)現(xiàn)，MC2R是5種黑素皮質(zhì)素受體（MC1R、MC2R、MC3R、MC4R和MC5R）中最特殊的，主要表現(xiàn)為：（1）其細(xì)胞膜表達(dá)以及功能的激活均需要黑素皮質(zhì)素受體2輔助蛋白1型（MRAP1）的協(xié)助；（2）MC2R只特異性地與ACTH結(jié)合而被激活，不能結(jié)合黑素細(xì)胞刺激素（MSH）等多肽（α-，β-，γ-and δ-MSH）。

MC2R在魚類應(yīng)激中的作用研究相對較少，對于應(yīng)激源刺激下MC2R的表達(dá)變化，以及ACTH或MSH相關(guān)肽類的刺激對皮質(zhì)醇合成釋放的影響雖已有部分研究[9-11]，但有機(jī)體在應(yīng)激源刺激后的恢復(fù)階段，機(jī)體調(diào)控使得MC2R表達(dá)以及皮質(zhì)醇水平產(chǎn)生的變化還未見報道。由于魚類在生長過程中不可避免會受到一定程度的刺激，了解應(yīng)激后恢復(fù)階段魚體主要應(yīng)激調(diào)控因子的變化狀況，對于幫助魚體快速恢復(fù)正常狀態(tài)、避免不必要的二次損傷具有重要意義。因此，本研究通過反轉(zhuǎn)錄PCR、RACE擴(kuò)增技術(shù)等獲得團(tuán)頭魴MC2R mRNA序列，分析了團(tuán)頭魴MC2R的組織分布特點，并通過捕撈出水體60 s對團(tuán)頭魴進(jìn)行急性應(yīng)激處理，探究團(tuán)頭魴MC2R的組織表達(dá)以及血清皮質(zhì)醇水平的變化，以期為團(tuán)頭魴等魚類應(yīng)激后調(diào)控措施的實施提供一定的參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

以團(tuán)頭魴為試驗對象，所用團(tuán)頭魴均由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心南泉基地提供，魚體健康，體表無傷痕，形態(tài)正常、無畸形，游動能力強(qiáng)。

1.2試驗設(shè)計

組織分布試驗所用組織分別取自12條團(tuán)頭魴，雌、雄各6條，體重（55.9±2.4） g，體長（15.4±0.1） cm，取表皮、肌肉、腸、脾、肝、中腎、頭腎、鰓、心臟、腦、眼、精巢和卵巢等13種組織。采樣前均采用終濃度為150 mg/L的MS-222在缸中對魚體直接進(jìn)行深度麻醉，快速解剖采取相應(yīng)組織。

捕撈脅迫試驗共取64條魚，體質(zhì)量（57.4±1.6） g，體長（15.3±0.2） cm，共分為4個組，每組2個缸，每缸8條魚，于玻璃缸中適應(yīng)2周后進(jìn)行試驗，處理條件為將魚迅速捕撈至網(wǎng)內(nèi)，并撈出水面60 s后放回水中，分別在脅迫前（設(shè)為 0 h）及捕撈脅迫后靜置（恢復(fù)階段）1、4、24 h采樣，采樣前采用終濃度為150 mg/L的MS-222在缸中對魚體直接進(jìn)行深度麻醉，快速尾靜脈采血，并依據(jù)組織分布試驗結(jié)果，采取MC2R主要表達(dá)組織頭腎、脾、腦和精巢。

1.3血清制備及血清皮質(zhì)醇的測定

采集到的血液立即10 000 r/min 4 ℃ 離心5 min，收集血清于-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｑ迤べ|(zhì)醇的測定采用化學(xué)發(fā)光免疫競爭法，在MAGLUMI 1000全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀上進(jìn)行檢測，試劑盒購自深圳新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程有限公司。

1.4組織樣品的準(zhǔn)備與總RNA提取

組織各0.05 ～ 0.1 g，用生理鹽水沖洗后加入1 mL RNAiso Plus（TaKaRa，Japan），立即用高通量組織破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）充分勻漿后使用，或凍存于 -80 ℃ 冰箱中備用。RNA的提取按照試劑的操作說明進(jìn)行，采用分光光度法和1%瓊脂糖凝膠檢測RNA條帶質(zhì)量，取D260 nm/D280 nm值在1.8～2.0之間的樣品。cDNA第一鏈反轉(zhuǎn)錄合成采用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，Japan），并按照使用說明處理RNA去除基因組DNA，以40 mg/L RNA的終濃度逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，獲得的cDNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5團(tuán)頭魴MC2R mRNA的克隆

1.5.1引物設(shè)計與合成團(tuán)頭魴MC2R mRNA全長克隆及實時熒光定量PCR所用引物均列于表1。內(nèi)參基因β-actin引物序列參照Ming等[12]，RPⅡ引物序列參照Zhao等[13]，其他引物設(shè)計采用Primer 5.0，所有引物的合成及序列測定均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司完成。表1團(tuán)頭魴MC2R mRNA克隆以及實時定量PCR所用引物

引物序列（5′-3′）用途P1F：GTACTGSTTYATCTGYARCCTGG；R：AASAGHGANCGGTARCAYTCRCA擴(kuò)增MC2R保守中間片段P21：GGCTATGGCGAGAATG；2：AAAAGGGCCACGGGAGTTCAG；3：GACGTCTTCTAATGCCTTGGARACE擴(kuò)增MC2R 5′端P31：TCACAGCTCTGCTCCTGATCCTCTTGC；2-1：ACGATGGACTCCAGTCCGGCC；Tail-PCR擴(kuò)增MC2R 3′端2-2：TTGATTGGAGTGTTTGTGGCCTGCTGG；2-3：CCTGCTGGGCTCCTTTCTTATTTCATCTMC2RF：ATGACAATGCGTCGTGTAGTGG；R：ATCCTGTTGGCGTGGTGGCReal-Time PCR擴(kuò)增MC2Rβ-actinF：TCGTCCACCGCAAATGCTTCTA；R：CCGTCACCTTCACCGTTCCAGTReal-Time PCR擴(kuò)增β-actinRPⅡF：CGCGAGTCATTCCTGTAACATC；R：TGACCCTTCCTCAGCTTTACCAReal-Time PCR擴(kuò)增RPⅡ注：簡并引物代碼S=G/C；Y=C/T；R=A/G；H=A/T/C；N=A/T/G/C。

1.5.2保守中間片段的擴(kuò)增通過同源序列比對設(shè)計兼并引物P1-R和P1-F（表1），以總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，分別PCR擴(kuò)增獲得MC2R的保守中間片段，產(chǎn)物經(jīng)純化、連接載體、轉(zhuǎn)化后測序。

1.5.3MC2R 3′和5′端的擴(kuò)增根據(jù)所獲得的部分中間片段，分別設(shè)計引物（表1）擴(kuò)增3′和5′端序列。MC2R的5′端序列采用Invitrogen公司的5′ RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends Version 2.0試劑盒獲得；3′端序列采用Tail PCR 的方法從基因組中獲得。產(chǎn)物均經(jīng)過純化并測序，序列拼接后，擴(kuò)增ORF全長并連接到pMD-18T載體測序進(jìn)行驗證。

1.6生物信息學(xué)分析

團(tuán)頭魴MC2R氨基酸序列與其他物種MC2R氨基酸序列的相似性分析以及序列比對均使用ClaustalW 2.0（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）進(jìn)行在線分析。通過Netphos K 1.0預(yù)測團(tuán)頭魴MC2R的蛋白激酶磷酸化位點（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhosK/），通過Netphos K 2.0預(yù)測團(tuán)頭魴MC2R的絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸磷酸化位點（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）。在MEGA 4.1中采用Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，1 000次自舉（Bootstrap）分析計算各節(jié)點支持率。根據(jù)牛視紫紅質(zhì)（BtaRHO）晶體結(jié)構(gòu)模型[14-15]進(jìn)行MC2R跨膜結(jié)構(gòu)域（transmembrane domain，TM）的預(yù)測。

1.7質(zhì)粒DNA及標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

含目的基因片段的質(zhì)粒載體制備如下：以cDNA為模板，用熒光定量PCR引物擴(kuò)增獲得目的片段；PCR程序條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化之后連接到pMD-18T載體并轉(zhuǎn)化到DH5α中構(gòu)建標(biāo)曲質(zhì)粒DNA。標(biāo)曲采用10倍連續(xù)梯度稀釋的5個點進(jìn)行構(gòu)建，選取的初始稀釋組的濃度設(shè)為100 000，模板濃度以lg值為橫坐標(biāo)，循環(huán)數(shù)CT值為縱坐標(biāo)，每個梯度點設(shè)置3個重復(fù)，在Microsoft Excel 2007中繪制并計算每個基因擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.8雙內(nèi)參實時定量PCR

根據(jù)獲得的團(tuán)頭魴MC2R mRNA序列設(shè)計熒光定量特異性引物，雙內(nèi)參基因（RPⅡ和β-actin）及MC2R引物序列在表1中列出。MC2R在團(tuán)頭魴組織中的表達(dá)分布情況，采用SYBG Primix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）Kit（TaKaRa，Japan）按操作說明在ABI 7500 Real Time PCR System上進(jìn)行。定量PCR體系為20 μL：2 μL cDNA模板、10 μL SYBR green mix、0.4 μL ROX、6.8 μL H2O、引物各0.4 μL。反應(yīng)程序設(shè)置為：第一階段（50 ℃ 2 min，95 ℃ 3 min），第二階段（95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40次循環(huán)），第三階段溶解曲線分析（95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s）。每個待測樣本同時進(jìn)行目的基因MC2R以及內(nèi)參基因RPⅡ和β-actin的擴(kuò)增，每次運行定量PCR都分析溶解曲線以確定無非特異性擴(kuò)增，陰性對照為2 μL滅菌雙蒸水，為保證混合均勻、減少加樣誤差，每個樣品均設(shè)置3次重復(fù)。

1.9數(shù)據(jù)處理

雙內(nèi)參熒光定量結(jié)果處理方法參照Vandesompele等[16]，采用2個內(nèi)參基因幾何平均值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法分析MC2R的表達(dá)量。得到的數(shù)據(jù)在SPSS 18.0軟件中采用One-way ANOVA分析團(tuán)頭魴MC2R在不同組織中的表達(dá)分布、捕撈脅迫后組織的表達(dá)變化以及血清皮質(zhì)醇水平的變化，顯著性檢驗水平設(shè)置為P<0.05。

2結(jié)果與分析

2.1團(tuán)頭魴MC2R mRNA序列

通過簡并引物擴(kuò)增獲得618 bp的MC2R基因中間片段，與其他物種MC2R具有很高的同源性；通過5′ RACE-PCR和3′ Tail-PCR擴(kuò)增，分別獲得長度為491 bp和1617 bp的擴(kuò)增片段，序列拼接獲得全長2 495 bp的片段，含有1個 915 bp 的開放閱讀框，編碼304個氨基酸（圖1，MC2R基因登錄號為KF962964），預(yù)測分子量大小為33.90 ku，pH值為7.0時的理論等電點為8.35；氨基酸組成中，強(qiáng)堿性氨基酸（K、R）21個，強(qiáng)酸性氨基酸（D、E）16個，疏水氨基酸（A、I、L、F、W、V）152個，極性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y）70個。

2.2團(tuán)頭魴MC2R的分子特征

ClaustalW分析發(fā)現(xiàn)，獲得的團(tuán)頭魴MC2R基因編碼的氨基酸序列與已報道的其他脊椎動物MC2R序列具有較高的同源性。其中團(tuán)頭魴MC2R與斑馬魚（Danio rerio）MC2R、鯉（Cyprinus carpio）MC2R、金魚MC2R氨基酸序列的同源性分別高達(dá)85%、83%和87%，與人（Homo sapiens）、牛（Bos taurus）、鼠（Mus musculus）、雞（Gallus gallus）等MC2R氨基酸序列的同源性僅50%左右（表2）。與其他魚類、四肢類的全長氨基酸序列進(jìn)一步的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果（圖2）表明，硬骨魚類MC2R聚為一大支，團(tuán)頭魴MC2R與鯉科魚類聚為一支，并與鯉MC2R的進(jìn)化距離最近。

與其他MCRs相類似，都具有短的EL和IL，使得MCRs成為最小的G蛋白偶聯(lián)受體，對團(tuán)頭魴MC2R與其他魚類、四肢類MC2R不同結(jié)構(gòu)區(qū)域的同源性分析發(fā)現(xiàn)，它們的不同結(jié)構(gòu)區(qū)域同源性具有不均衡分布的特征。由圖3序列比對統(tǒng)計的同源性比例表明，團(tuán)頭魴MC2R與其他魚類及四肢類MC2R在TM2、TM3、TM6和TM7區(qū)的平均同源性分別為

表2團(tuán)頭魴MC2R與其他來源物種氨基酸序列同源性比較

簡稱種名基因

登錄號與團(tuán)頭魴

同源性

（%）MamMC2R團(tuán)頭魴KF962964100.00HamMC2R人（Homo sapiens）NP_00052050.34BtaMC2R牛（Bos taurus）XP_00589241748.28MmuMC2R鼠（Mus musculus）NP_00125864550.17GgaMC2R雞（Gallus gallus）NP_00102668648.68DlaMC2R狼鱸（Dicentrarchus labrax）CCA9511060.27VmoMC2R條斑星鰈（Verasper moseri）BAI6659557.91TruMC2R紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）NP_00102793656.61OmyMC2R虹鱒（Oncorhynchus mykiss）NP_00111815262.46DreMC2R斑馬魚（Danio rerio）NP_85130284.87CauMC2R金魚（Carassius auratus）BAJ8347283.44CcaMC2R鯉（Cyprinus carpio）CAE5384586.51CmiMC2R米氏葉吻銀鮫（Callorhinchus milii）FAA0070443.43

61%、66%、68%和76%，同時MC2R在EL3、IL1和IL2區(qū)的同源性更高，分別為84%、83%和80%。

團(tuán)頭魴MC2R具有G蛋白偶聯(lián)受體視紫紅質(zhì)家族A所共有的保守基序DRY（Asp、Arg、Tyr），以及在多數(shù)MCRs中都具有保守性的3個半胱氨酸（Cys232、Cys246、Cys252）（http：//www.gpcr.org/）和大多數(shù)MCRs都具有的保守基序PMY（Pro、Met、Try）。團(tuán)頭魴MC2R的Thr137處為該受體的可能的PKC磷酸化位點，推測分析顯示Tyr123，251、Ser32，70，203，214、Thr287為潛在的磷酸化位點。

2.3團(tuán)頭魴MC2R在不同組織中的表達(dá)分析

MC2R的表達(dá)量通過實時熒光定量PCR雙標(biāo)曲線法進(jìn)行測定和分析，目的基因和內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)見表3。

MC2R組織分布的結(jié)果顯示，MC2R除了在頭腎中存在大量的表達(dá)外，在其他12種組織中也均有不同程度的表達(dá)，脾中MC2R也具有很高的表達(dá)量，其次在精巢和腦中的表達(dá)量也相對較高，其他組織中的表達(dá)量則較微量。

2.4捕撈脅迫后團(tuán)頭魴皮質(zhì)醇和MC2R的調(diào)控變化

捕撈脅迫后，團(tuán)頭魴血清皮質(zhì)醇水平在1 h內(nèi)迅速升高，在恢復(fù)4 h后皮質(zhì)醇水平仍表現(xiàn)出顯著升高的趨勢（P<005），在24 h時逐漸恢復(fù)至應(yīng)激前的水平

捕撈脅迫后，1 h時團(tuán)頭魴頭腎、脾、精巢和腦中的MC2R表達(dá)量均有微弱的升高但差異不顯著，頭腎MC2R表達(dá)量4 h時雖仍有升高趨勢，但差異也不顯著；脾、精巢和腦中MC2R的表達(dá)變化與頭腎MC2R不同，脾、精巢和腦中MC2R表達(dá)量在捕撈脅迫后4 h時呈現(xiàn)顯著的下降；捕撈脅迫后24 h時4種組織中MC2R的表達(dá)量均逐漸恢復(fù)（圖6）。

3討論

3.1團(tuán)頭魴MC2R序列分析

本研究克隆得到的團(tuán)頭魴MC2R氨基酸序列與其他脊椎動物MC2R氨基酸序列具有較高的同源性，系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，團(tuán)頭魴MC2R與其他鯉形目魚類，如斑馬魚、鯉和金魚等聚為一支，與傳統(tǒng)的物種進(jìn)化地位基本一致。

Hoffmann 等認(rèn)為，GPCRs位于細(xì)胞膜表面的N端區(qū)域、胞外環(huán)，跨膜結(jié)構(gòu)在膜表面形成親水性腔的部分氨基酸殘基，以及GPCR與膜結(jié)合區(qū)域暴露于胞外的部分氨基酸殘基都可能參與GPCR與其配體的結(jié)合[17]。然而由于目前缺乏MCRs的晶體結(jié)構(gòu)的構(gòu)造模型，阻礙了MCRs具體配體結(jié)合位點的研究。基于視紫紅質(zhì)類GPCRs具有相同的激活機(jī)制，本研究采用已知的牛視紫紅質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)模型預(yù)測了團(tuán)頭魴MC2R的跨膜結(jié)構(gòu)域[14-15]，結(jié)果顯示，團(tuán)頭魴MC2R與狼鱸（Dicentrarchus labrax）[10]、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[11]等MC2R的氨基酸結(jié)構(gòu)類似，跨膜區(qū)TM2、TM3、TM6、TM7以及EL3、IL1、IL2等區(qū)域均表現(xiàn)出很高的同源性。而TM2、TM3、TM6和TM7區(qū)域被認(rèn)為是MCRs與其配體MSH肽類結(jié)合的主要區(qū)域[18-19]。但是哺乳類[5]以及虹鱒[11]等魚類的MC2R被證實

表3熒光定量PCR各基因標(biāo)準(zhǔn)曲線信息

基因標(biāo)準(zhǔn)曲線方程回歸系數(shù)

（r2）擴(kuò)增效率

（%）MC2Ry=-3.391x+34.0690.999 697.22RPⅡy=-3.259x+33.6470.998 6102.49β-actiny=-3.521x+31.4350.999 992.30注：x為相對濃度的lg值，y為熒光定量PCR獲得的CT值。

不能與MSH肽類結(jié)合來調(diào)節(jié)皮質(zhì)醇的合成，這些區(qū)域在結(jié)合ACTH上的特點還有待考證。鑒于EL3較各TM區(qū)域同源性較高，我們推測EL3可能在MC2R與ACTH的結(jié)合上發(fā)揮著更重要的作用。然而隨著低等脊椎動物MC2R被克隆，研究者發(fā)現(xiàn)軟骨魚類米氏葉吻銀鮫（Callorhinchus milii）[20]MC2R雖然也與團(tuán)頭魴等魚類跨膜區(qū)具有高度的同源性，但是米氏葉吻銀鮫MC2R不需要MRAP1協(xié)助便能在細(xì)胞膜表面表

達(dá)，同時與ACTH或MSH等肽類結(jié)合均能使MC2R激活。綜上，MC2R復(fù)雜的配體結(jié)合能力，其配體結(jié)合位點的研究有待補(bǔ)充。

3.2MC2R在團(tuán)頭魴不同組織中的表達(dá)

本研究表明MC2R在頭腎中表達(dá)量最高，這與頭腎是ACTH作用的主要區(qū)域，并且含有大量的皮質(zhì)素細(xì)胞相關(guān)。除在頭腎中大量表達(dá)外，團(tuán)頭魴脾中MC2R的表達(dá)量僅略低于頭腎。與本研究結(jié)果類似，在對狼鱸[10]的研究中發(fā)現(xiàn)，除頭腎外，其脾中也檢測到了表達(dá)量可觀的MC2R。由于頭腎和脾中存在大量的巨噬細(xì)胞，而且多項研究證實應(yīng)激對多種魚類免疫相關(guān)基因均能產(chǎn)生影響[21-22]，因此MC2R在團(tuán)頭魴頭腎和脾臟中大量共表達(dá)，表明團(tuán)頭魴體內(nèi)的應(yīng)激調(diào)節(jié)進(jìn)一步印證了Agulleiro等[10]的推測，MC2R的激活在調(diào)節(jié)腎間組織合成釋放皮質(zhì)醇的同時，可通過內(nèi)分泌途徑使得應(yīng)激對免疫應(yīng)答產(chǎn)生影響。

有研究表明，ACTH在斑馬魚促性腺激素刺激卵泡細(xì)胞釋放雌二醇的過程中具有一定的調(diào)控作用[23]。而且在虹鱒MC2R分布的研究中，精巢與卵巢中均檢測到大量表達(dá)的MC2R，而本研究中發(fā)現(xiàn)精巢中MC2R具有很高的表達(dá)量，約為卵巢的3倍，卵巢中MC2R的表達(dá)量較少，條斑星鰈（Verasper moseri）[9]腺MC2R具有與本研究結(jié)果類似的表達(dá)比例。這些研究的發(fā)現(xiàn)使得我們推測，魚類ACTH可能通過MC2R的激活通路調(diào)控性腺功能，MC2R在魚類性腺中的作用及其具體機(jī)制還有待探討。

雖然MC2R在四肢類的腦中未見明顯表達(dá)[24-26]，但是與本研究結(jié)果類似，一些魚類包括虹鱒[11]和條斑星鰈，它們的腦組織中存在大量表達(dá)的MC2R，這可能是MC2R參與神經(jīng)中樞對應(yīng)激源刺激的應(yīng)答，調(diào)控皮質(zhì)醇的釋放。

3.3捕撈脅迫對團(tuán)頭魴MC2R表達(dá)的影響

如圖6所示，本試驗捕撈脅迫60 s對團(tuán)頭魴恢復(fù)期內(nèi)頭腎MC2R的表達(dá)無顯著影響。而有研究表明[11]，急性捕撈應(yīng)激5 min后恢復(fù)1 h時，虹鱒血清ACTH顯著升高，腎間組織MC2R則表現(xiàn)出一定的延遲性，在恢復(fù)4 h時MC2R才表現(xiàn)出顯著的升高。本研究未能測得ACTH的表達(dá)變化，然而本研究對團(tuán)頭魴僅應(yīng)激了60 s，可能由于時間過短，對團(tuán)頭魴機(jī)體MC2R轉(zhuǎn)錄水平未能造成顯著影響，但使得MC2R表達(dá)有持續(xù)升高的趨勢，MC2R表達(dá)的上調(diào)調(diào)控了下游皮質(zhì)醇水平的顯著變化。

在捕撈應(yīng)激恢復(fù)4 h后皮質(zhì)醇水平經(jīng)較緩慢的增長達(dá)到最高，這與紅鯛[27]捕撈應(yīng)激2 h時皮質(zhì)醇仍有升高類似。此時團(tuán)頭魴血清皮質(zhì)醇水平處于最大值，但除頭腎外，腦、脾和性腺的MC2R表達(dá)量均出現(xiàn)顯著的下降。其可能原因是在應(yīng)激后1 h內(nèi)，團(tuán)頭魴由于應(yīng)激源刺激，各組織MC2R表達(dá)量有一定的上調(diào)（圖6），但應(yīng)激強(qiáng)度不足以造成MC2R表達(dá)量產(chǎn)生顯著的變化；同時MC2R的上調(diào)促進(jìn)皮質(zhì)醇的合成，并能造成血清皮質(zhì)醇水平顯著升高。魚類與哺乳動物類似，皮質(zhì)醇可以通過負(fù)反饋作用刺激下丘腦，降低HPI軸的活性[28]。該捕撈脅迫雖不能顯著提高M(jìn)C2R表達(dá)量，但1～4 h時頭腎MC2R表達(dá)量的上調(diào)，造成團(tuán)頭魴皮質(zhì)醇水平的持續(xù)升高，在4 h時達(dá)到最高，但由于存在負(fù)反饋調(diào)控系統(tǒng)，在皮質(zhì)醇升高到一定程度便能通過負(fù)反饋作用于下丘腦，首先使得脾、腦和性腺MC2R的表達(dá)水平顯著降低，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、中樞系統(tǒng)以及生殖系統(tǒng)恢復(fù)應(yīng)激前的狀態(tài)。由于機(jī)體應(yīng)激后的調(diào)控十分復(fù)雜，涉及到神經(jīng)、內(nèi)分泌以及免疫等一系列活動，同時不同魚類對應(yīng)激的反應(yīng)強(qiáng)度也各有不同，因此，還需更多的研究以揭示應(yīng)激中各調(diào)控因子的作用機(jī)制。

值得注意的是，在4 h時團(tuán)頭魴皮質(zhì)醇水平以及MC2R表達(dá)水平分別表現(xiàn)為顯著上升和顯著下降，我們推測此時魚體各組織可能受皮質(zhì)醇作用急劇變化的影響，魚體在此階段機(jī)體代謝可能處于最脆弱的階段，受外界因素干擾后極易對機(jī)體造成損傷，建議在養(yǎng)殖實踐中，拉網(wǎng)后應(yīng)盡量保證魚體在此階段內(nèi)不受干擾，以免對魚體造成危害。

本研究成功克隆了團(tuán)頭魴MC2R基因，序列分析及進(jìn)化分析顯示團(tuán)頭魴MC2R氨基酸序列與其他魚類以及四肢類MC2R具有很高同源性，EL3可能是MC2R與配體結(jié)合的重要區(qū)域。團(tuán)頭魴MC2R組織分布特性與其他動物類似，除了在頭腎中有不同程度的表達(dá)外，在脾、腦以及性腺中也有較高的表達(dá)量，可能參與相關(guān)系統(tǒng)的生理功能調(diào)控。本研究首次討論了團(tuán)頭魴應(yīng)激恢復(fù)時MC2R表達(dá)與皮質(zhì)醇合成的關(guān)系，結(jié)果顯示在4 h時，皮質(zhì)醇水平與MC2R表達(dá)水平均處于顯著水平，推測此時可能是應(yīng)激后外界環(huán)境的變化對團(tuán)頭魴機(jī)體最易造成損傷的時候。

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