轉鐵蛋白偶聯熒光納米鉆石靶向體系的制備及HeLa細胞吸收機制研究

田志梅,曹瑞霞,王東新,李 林,王 青,王志琴,李英奇,

(山西大學 a.分子科學研究所、化學生物學與分子工程教育部重點實驗室; b.化學化工學院 太原 030006)

轉鐵蛋白偶聯熒光納米鉆石靶向體系的制備及HeLa細胞吸收機制研究

田志梅a,曹瑞霞b,王東新a,李 林a,王 青b,王志琴b,李英奇a,b

(山西大學 a.分子科學研究所、化學生物學與分子工程教育部重點實驗室; b.化學化工學院 太原 030006)

以熒光納米鉆石(FND)作為藥物載體和探針,轉鐵蛋白(Tf)作為靶向配體,聚賴氨酸(PL)做橋梁,制備了熒光納米鉆石-聚賴氨酸-轉鐵蛋白(FND-PL-Tf)靶向納米顆粒；以人宮頸癌細胞(HeLa cells)為體外模型,研究靶向納米顆粒與細胞的作用,探討細胞攝取納米顆粒的轉運機制,為納米顆粒靶向輸送藥物和腫瘤檢測提供有價值的理論依據。結果表明細胞攝取FND-PL-Tf納米顆粒的數量與顆粒濃度、時間及納米顆粒表面偶聯轉鐵蛋白量有關;由物理吸附或共價偶聯Tf獲得的FND-PL-Tf納米顆粒均為網格蛋白決定、轉鐵蛋白受體介導機制進入細胞。這些研究表明FND-PL-Tf納米顆粒具有潛在的靶向輸送藥物和腫瘤靶向檢測功能。

熒光納米鉆石; 聚賴氨酸;轉鐵蛋白;細胞吸收機制

隨著納米科技的進展,納米材料在生物醫藥方面的應用日益受到關注[1]。近十幾年來,以碳材料為基礎的納米材料,如納米鉆石、炭黑、碳納米管和富勒烯等,針對生物毒性及生物兼容性問題,開始積極測試。 Dai Liming， Zhao Yuliang，Zhang X Y 等課題組證實納米鉆石具有最低毒性和高生物兼容性[2-5],可能成為生物醫用中的一項新材料。更可喜的是近來臺灣張教授組通過對大鼠腹腔注射納米鉆石進行了長期(5個月)穩定性和生物兼容性實驗發現大鼠沒有表現出任何不良反應,再次證明納米鉆石的高生物相容性[6]。此外,納米鉆石經強酸氧化處理后,表面富含羧基,可進一步與蛋白[7-8]、藥物[9-11]等作用,實現納米鉆石載藥功能。更使人激動的是,經過40 keV He+輻照合成的Type1b 納米鉆石,可以使其具有(N-V)-點缺陷中心,這就是其發紅色熒光機制[12],因此把它稱作熒光納米鉆石(FND)。熒光納米鉆石具有無光漂白現象、寬的光譜范圍以及熒光壽命長等優點,所以用FND來標記細胞或生物分子以觀察診斷,如應用于細胞內定位和檢測[6,11,12]。

由于FND在細胞培養基(含10%的血清)中容易聚集導致細胞吸收率低,但經過表面修飾或負載藥物后可以防止聚集且能進入細胞[11,14]。大量研究表明,納米顆粒與蛋白或具有生物活性的配體偶聯,能提高它們的穩定性和細胞吸收的有效性[15],適合偶聯納米顆粒的轉鐵蛋白是分子量約80 kDa的單肽鏈非血紅素糖蛋白,是脊椎動物體內鐵(Ⅲ)的運輸者,主要是轉鐵蛋白受體介導途徑。轉鐵蛋白受體能在人體內廣泛表達,但它的表達量有明顯差別,腫瘤細胞具有高表達轉鐵蛋白受體特性,是正常細胞表達量的2～10倍,利用轉鐵蛋白-轉鐵蛋白受體專一性結合已成為一種有效的藥物轉運途徑[16-18]。因此轉鐵蛋白與納米顆粒的偶聯成為受體介導目標藥物和基因運輸的材料,這些材料包括量子點、碳納米管、磁性納米粒子、金納米以及多孔硅納米顆粒等[19-22],但他們均具有不同程度的毒副作用。Michal Babic等[23]研究了聚賴氨酸(PL)包被納米顆粒進入細胞的效果優于單獨的納米顆粒。

鑒于熒光納米鉆石的高生物兼容性、發紅色熒光特性和聚賴氨酸正電荷特點,我們利用FND作為熒光探針和載體,PL為橋梁,Tf為靶向配體,制備了靶向納米FND-PL-Tf載體,并對其進行了表征。以HeLa細胞為體外模型,對靶向納米材料FND-PL-Tf與細胞的作用機制進行了探討,為FND-PL-Tf靶向輸送藥物和腫瘤檢測提供理論依據。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

熒光納米鉆石(Element Six,由臺灣中央研究院提供,粒徑為～140 nm),人轉鐵蛋白(Tf,Sigma),聚賴氨酸(PL,Sigma),1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC,Sigma),N-羥基琥珀酰亞胺(NHS,Sigma),2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES,Sigma),細胞培養基 DMEM(賽默飛世爾生物化學制品有限公司),胎牛血清(FBS,杭州四季青生物工程材料有限公司),胰蛋白酶(Trypsin,Amresco),EDTA(北京化工廠),實驗中所用化學試劑均為分析純。細胞培養用水為三次蒸餾水,其它用水為一次蒸餾水,HeLa 細胞由山西大學生物技術所提供。

電子天平(AL204,上海梅特勒-托利多儀器有限公司),超聲波清洗器(KQ-100DE,江蘇昆山市超聲儀器有限公司),微量高速離心機(TG16-W,湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司),搖勻儀(DR-MTX,北京昊諾斯生物科技有限公司),pH 計(DELTA320,上海梅特勒-托利多儀器有限公司),紫外-可見分光光度計(Cary Eclipse,美國 VARIAN 公司),馬爾文納米粒度儀(ZETSizer,Nano-ZS90，英國馬爾文),激光共聚焦顯微鏡(TCS SP5,德國 Leica 公司),流式細胞儀(FACSCalibur,美國 BD 公司)。

1.2 靶向材料FND-PL-Tf的制備

1.2.1FND-PL的制備

準確稱取5 mg 羧基化的FND(經強酸氧化)[11]置于離心管中,加入pH為8.40的硼酸3 mL緩沖溶液,超聲分散30 min形成懸濁液,接著向其中加入10 mg EDC、10 mg NHS,繼續超聲分散30 min,然后加入2.5 mg PL,室溫下搖勻3 h。待反應結束,于高速離心機上離心,用硼酸緩沖溶液洗滌三次,棄去上清液,得到沉淀物FND-PL納米顆粒懸于5 mL硼酸緩沖液中備用。

1.2.2FND-PL-Tf的制備

共價偶聯方法:稱取5 mg Tf溶于1 mL MES(pH 6.0)緩沖液,量取200 μL Tf(5 mg/mL)溶液,加入EDC預處理Tf 30 min,接著準確量取1 mL FND-PL懸濁液(1.0 mg/mL),然后將處理的Tf加入FND-PL的懸濁液中,在搖勻儀上反應3 h,于15 000 r/min離心5 min,用硼酸緩沖液清洗沉淀三次,收集每次的離心上清液,分別測定其吸光度值,根據摩爾消光系數(ε278=93 000 mol-1cm-1)求出游離 Tf 濃度,計算加入 Tf 總量與上清液中游離的 Tf 量之差,即為 FND-PL偶聯 Tf 的量[11]。所得沉淀即為FND-PL-Tf。將沉淀物懸于硼酸緩沖液中備用。

物理吸附方法:準確量取制備的FND-PL懸濁液(1.0 mg/mL)1 mL,加入1 mg Tf,在搖勻儀上搖勻3h,反應結束后,處理方法同上。吸附Tf的量為186 μg/mg。

1.3 靶向材料FND-PL-Tf的表征

1.3.1紅外光譜儀測定

用傅里葉變換紅外光譜儀表征納米粒子FND,FND-PL和FND-PL-Tf。

1.3.2激光粒度分析儀測定

將一定質量的納米粒子FND,FND-PL和FND-PL-Tf置于去離子水中并超聲分散30 min,使之成為合適濃度的懸濁液,用激光粒度分析儀及高分辨Zeta電位,分別測定納米顆粒的粒徑及表面Zeta電位。

1.4FND-PL偶聯Tf量的確定及FND-PL-Tf進入細胞的最佳條件

分別準確量取含FND-PL納米顆粒 1 mg的懸濁液置于5個2 mL離心管,向其中分別加入EDC預處理好的不同質量的Tf,在搖勻儀上反應3 h,反應結束后,處理方法同上。繪制偶聯曲線。

取對數生長期 HeLa 細胞以 1.5×105/dish 的密度接種于35 mm培養皿中,培養16 h后,分別加入偶聯Tf量為93, 188和238 μg/mg的FND-PL-Tf于 37℃孵育2 h,將細胞外的納米顆粒吸棄,用冷PBS緩沖液洗滌兩次,而后用胰酶消化,形成細胞懸液,再用冷的PBS清洗2次,重新懸于冷PBS中,最后將上述樣品用流式細胞儀檢測,以未做過任何處理的HeLa細胞作為空白對照。(FND-PL-Tf:激發波長635 nm,接收波長大于650 nm)。

1.5 細胞內吞FND-PL-Tf 的靶向機制

取對數生長期 HeLa 細胞以 1.5×105/dish 的密度接種于35 mm培養皿中,培養16 h后,向培養皿中加入1 mg 游離Tf預處理細胞30 min,接著加入FND-PL-Tf(按FND為50 μg/mL加入)于37℃繼續與細胞孵育2 h，只加FND-PL-Tf的細胞作對照。用流式細胞儀測定細胞內吞納米顆粒的熒光強度。

1.6 細胞內吞FND-PL-Tf的轉運機理

取對數生長期 HeLa 細胞以 1.5×105/dish 的密度接種于含蓋玻片的35 mm培養皿中,培養16 h后,分別用0.01 mol/L NaN3和0.05 mol/L 2-deoxy-D-Glucose、0.45 mol/L sucrose預處理細胞30 min,再將10 μg/mL FND-PL-Tf 分別加入以上培養皿中,于 37℃繼續孵育3 h,此外將10 μg/mL FND-PL-Tf加入0℃的培養皿孵育3 h,用 PBS 洗去細胞表面FND-PL-Tf,加蓋玻片的培養皿用 4%多聚甲醛室溫固定 8 min,冷 PBS 沖洗細胞三次,取出蓋玻片置于載玻片上,于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察并拍照(激發波長 535 nm,接受波長 600～700 nm 測定 FND的紅色熒光信號)。用同樣方法處理細胞,用流式細胞儀測定細胞內吞納米顆粒的熒光強度。

1.7 細胞內吞FND-PL-Tf 的動力學

取對數生長期 HeLa 細胞以 1.5×105/dish 的密度接種于35 mm培養皿中,培養16 h后,分別加入30 μg/mL FND-PL-Tf 于 37℃分別孵育0,0.5,1,2,3,5,8,17 h,用流式細胞儀測定細胞內吞納米顆粒的熒光強度。

2 實驗結果與分析

2.1 FND-PL-Tf的制備及表征

為了探討不同分子制備的靶向納米鉆石材料被細胞攝取的影響,我們在前期制備的熒光納米鉆石-轉鐵蛋白材料的基礎上[11],進一步選用聚賴氨酸做交聯劑,制備了新型納米載體FND-PL-Tf,制備過程示意圖如圖1所示。

圖1 FND-PL-Tf 納米顆粒制備過程示意圖

采用傅里葉變換紅外光譜儀對其進行表征,結果如圖2所示。其中,a為FND的紅外光譜,可以看到FND表面富含-OH和-COOH; b為FND-PL的紅外光譜,3 255 cm-1為N-H伸縮振動,1 668 cm-1為C=O伸縮振動(酰胺I帶),1 539 cm-1為N-H彎曲振動(酰胺Ⅱ帶);c為FND-PL-Tf的紅外光譜,3 308 cm-1為N-H伸縮振動,1 659 cm-1為C=O伸縮振動(酰胺I帶),1 539 cm-1為N-H彎曲振動(酰胺II帶),而C=O峰依次從1 792 cm-1轉變為1 771 cm-1和1 763 cm-1,且峰強度依次變弱,表明獲得FND-PL-Tf納米顆粒。

a—FND;b—FND-PL;C—FND-PL-Tf

用激光粒度分析儀測定不同納米顆粒的粒徑大小和Zeta電位值,結果如表1。由表1可知,隨著PL和Tf依次與FND偶聯,粒徑大小依次增大,FND-PL的Zeta電位值明顯高于羧基化的FND,這是由于PL在去離子水中帶正電荷的緣故,表明PL與FND偶聯；在此基礎上繼續偶聯帶負電荷的Tf,從FND-PL-Tf與FND-PL的Zeta電位值比較,可見前者的電位值顯著低于后者,充分表明FND-PL和FND-PL-Tf已經制得。

表1 不同納米顆粒的粒徑和Zeta電位值Table 1 The size and Zeta potential of different nanoparticles

為確定FND-PL納米顆粒偶聯Tf的最大飽和量,用不同質量的Tf 與一定質量的FND-PL納米顆粒反應,得到圖3所示的曲線,由圖可見,在一定范圍內,FND-PL對Tf的吸附量隨Tf量的增加而增加,當Tf超過一定量,隨著Tf量的增加FND-PL對Tf的偶聯量不再增加而趨于恒值,即此時FND-PL偶聯Tf已達到飽和,最大偶聯量約(238±8.95) μg/mg,約是FND直接偶聯Tf的2.4倍[8],這可能主要與FND和Tf直接偶聯有空間位阻效應有關。

圖3 FND-PL納米顆粒偶聯Tf的偶聯曲線

2.2FND-PL-Tf進入細胞的最佳條件和細胞攝取機制研究

通過流式細胞技術測定FND-PL-Tf納米顆粒在細胞內的熒光強度信號,可以間接反應納米顆粒進入細胞的量的多少。為進一步研究制備得FND-PL-Tf納米顆粒進入細胞是否與表面偶聯的Tf量有關,我們選取FND-PL偶聯Tf的量分別為93, 188 ,238 μg/mg的FND-PL-Tf納米顆粒與HeLa cells作用,結果如圖4-a所示,隨著納米顆粒濃度的提高,細胞攝取納米顆粒的數量增加。有趣的是,偶聯最多Tf 的FND-PL-Tf納米顆粒,進入細胞的量最少,偶聯量為188 μg/mg的FND-PL-Tf納米顆粒進入細胞最多,這可能與空間位阻效應密切相關。該實驗結果充分表明細胞攝取FND-PL-Tf納米顆粒的多少與表面偶聯Tf的量有關。

鑒于以上現象,我們選取偶聯Tf的量為188 μg/mg的FND-PL-Tf納米顆粒為研究對象,進一步研究其進入細胞是否是轉鐵蛋白受體介導途徑。根據轉鐵蛋白-轉鐵蛋白受體之間的高度親和力,若FND-PL-Tf納米顆粒進入細胞由表面偶聯的轉鐵蛋白決定,則可用游離轉鐵蛋白做竟爭劑,研究細胞攝取FND-PL-Tf納米顆粒的靶向途徑。結果如圖4-b所示,由于游離轉鐵蛋白的存在,FND-PL-Tf納米顆粒進入細胞的熒光強度顯著降低,抑制率達到87.7%,這是由于游離轉鐵蛋白占據細胞表面轉鐵蛋白受體的緣故,因此可以推斷細胞內吞FND-PL-Tf納米顆粒是轉鐵蛋白受體介導機制。這一結果預示FND-PL-Tf納米顆粒能夠被細胞表面表達轉鐵蛋白受體高的癌細胞主動識別,提高腫瘤細胞的檢測效應。

4-a 細胞對FND-PL-Tf偶聯不同Tf量的攝取

4-b 細胞攝取FND-PL-Tf (FND-PL共價偶聯Tf)的機制

FND-PL共價偶聯Tf形成的FND-PL-Tf納米顆粒是轉鐵蛋白受體介導途徑,那么通過FND-PL物理吸附Tf形成的FND-PL-Tf納米顆粒進入細胞的途徑是否相似呢?為了證明這一假設,我們同樣采用游離轉鐵蛋白做競爭劑,抑制率達到84.5%,結果表明通過FND-PL物理吸附Tf形成的FND-PL-Tf納米顆粒也是轉鐵蛋白受體介導途徑(數據未顯示)。通過兩種方法制備得FND-PL-Tf納米顆粒進入細胞的靶向性均比FND-Tf[8]提高了約2倍。這個結果可能由兩種原因引起:

1) 充分表明FND-PL-Tf納米顆粒由于PL做橋梁,克服了轉鐵蛋白與納米鉆石直接偶聯的空間位阻效應,使得FND-PL-Tf納米顆粒能夠與細胞表面的轉鐵蛋白受體緊密接觸,親和力提高,靶向效果顯著改善;

2) FND-PL-Tf納米顆粒的Zeta電位為正值,FND-Tf的Zeta電位為負值,而帶負電荷的細胞易與帶正電荷的納米顆粒作用。

為了探究細胞內吞FND-PL-Tf納米顆粒的轉運機制,選用低溫和不同抑制劑研究了FND-PL-Tf納米顆粒與細胞的作用,結果如圖5-a所示。由于0℃下細胞膜脂流動性會降低,外源性物質與細胞膜的相互作用會受到影響,導致細胞對外源性物質的攝取效率降低[24-25]。由圖5可看出0 ℃時,FND-PL-Tf的細胞攝取量比37 ℃明顯降低,抑制率達到67%。NaN3可抑制細胞色素氧化酶阻斷線粒體呼吸鏈,從而阻斷細胞內ATP的形成。用NaN3預處理細胞發現FND-PL-Tf的細胞攝取量下降,抑制率達到50%,說明FND-PL-Tf進入細胞是一個主動的、能量依賴的內吞過程。為進一步探討FND-PL-Tf以何種內吞方式進入HeLa細胞,選用抑制劑蔗糖(Sucrose)預處理細胞。Sucrose可擾亂網格蛋白包被小泡(clathrin-coated vesicles)的形成,影響clathrin介導的內吞途徑,從圖5A可以看到Sucrose對HeLa攝入FND-PL-Tf的抑制率達50%,結果表明FND-PL-Tf進入細胞以clathrin介導的內吞途徑。

5-a—流式細胞儀定量檢測低溫(0℃)和不同抑制劑對細胞攝入FND-PL-Tf的影響

5-b—運用激光共聚焦顯微鏡觀察

運用激光掃描共聚焦顯微鏡研究FND-PL-Tf的細胞轉運機理,可以觀察到FND-PL-Tf納米顆粒在細胞內主要位于細胞質5B。用0℃、抑制劑NaN3和Sucrose預處理細胞后FND-DOX進入細胞的量明顯少于37℃對照,更進一步證明了FND-PL-Tf是以clathrin介導的內吞途徑進入HeLa細胞。

2.3 FND-PL-Tf進入細胞具有時間依賴性

6-a—不同時間細胞內吞FND-PL-Tf納米顆粒的熒光強度

6-b—不同時間細胞內吞FND-PL-Tf納米顆粒的動力學曲線(數據選取圖A)

以共價偶聯方式形成的FND-PL-Tf納米顆粒為研究對象,對其進入細胞動力學做探討,結果如圖6所示。隨著細胞與FND-PL-Tf納米顆粒孵育時間的延長,細胞內的熒光強度明顯增強(6-a), 黑色曲線為細胞自發熒光,表明FND-PL-Tf進入細胞的量逐漸增加。圖 6-b為圖6-a中細胞內的熒光強度與孵育時間的動力學曲線示意圖,由圖可見,隨著時間的增加,細胞攝取的FND-PL-Tf納米顆粒逐漸增多,當5 h時FND-PL-Tf進入細胞的量達到一平臺,熒光強度隨時間延長不再發生改變,表明FND-PL-Tf進入細胞的量已經達到飽和。按一級反應動力學擬合計算得到速率常速為k=(0.462±0.046)h-1,比我們曾報道[8]的FND-Tf進入細胞的速率常數 (0.55±0.067) h-1小。這是由于納米顆粒粒徑越大,網格蛋白包裹時間越長,則其進入細胞速率越慢[26]。盡管FND-PL-Tf納米顆粒的Zeta電位為正值(19.6 mV),FND-Tf的Zeta電位為負值(-15.0 mV)[8], 與帶負電荷的細胞作用時應當前者更有利,但FND-PL-Tf(～233 nm)納米顆粒粒徑大于FND-Tf(～221 nm)納米顆粒的粒徑[8],可見FND-PL-Tf進入細胞主要受粒徑大小控制,因此FND-PL-Tf進入細胞的速率比FND-f進入細胞的速率慢一些。

3 結論

我們選用聚賴氨酸做橋梁,首先與強酸氧化后的熒光納米鉆石共價偶聯獲得FND-PL納米顆粒,接著共價偶聯轉鐵蛋白制備了轉鐵蛋白修飾的FND-PL-Tf納米顆粒,利用傅里葉變換紅外光譜儀、激光粒度分析儀對FND-PL-Tf進行了表征。用不同濃度的轉鐵蛋白與FND-PL偶聯獲得最大偶聯量為每毫克FND-PL納米顆粒偶聯(238±8.95)μg Tf。以HeLa細胞為模型,由偶聯不同Tf量的FND-PL-Tf與細胞作用,發現偶聯Tf最大的FND-PL-Tf進入細胞最少,這一結果表明細胞攝取FND-PL-Tf的量與偶聯Tf的量有關。由FND-PL-Tf進入細胞機理研究,表明通過FND-PL共價偶聯或物理吸附Tf形成的FND-PL-Tf均由轉鐵蛋白受體介導進入細胞,此外細胞內吞FND-PL-Tf納米顆粒具有能量、時間依賴性和網格蛋白決定的過程,按一級擬合得出FND-PL-Tf進入細胞的速率常數k=(0.462±0.046)h-1。研究表明獲得的FND-PL-Tf納米顆粒具有潛在的靶向輸送藥物和檢測腫瘤效應。

致謝：感謝臺灣中央研究院 H. C. Chang 教授提供的熒光納米鉆石。

[1]Lien Z Y, Hsu T C, Liu K K, et al. Cancer cell labeling and tracking using fluorescent and magnetic nanodiamond[J]. Biomaterials, 2012, 33(26): 6172-6185.

[2]Schrand A M, Huang H, Carlson C, et al. Are diamond nanoparticles cytotoxic[J]. Physical Chemistry B, 2007, 111(1): 2-7.

[3]Schrand A M, Dai L M, Schlager J J. Differential biocompatibility of carbon nanotubes and nanodiamonds[J]. Diamond and Related Material, 2007, 16(12): 2118-2123.

[4]Jia G, Wang H, Yan L, et al. Cytotoxicity of carbon canomaterials: single-wall nanotube, multi-wall Nanotube, and fullerene[J]. Environment Science Technology, 2005, 39(5): 1378-1383.

[5]Zhang X Y, Hu W B, Li J, et al. A comparative study of cellular uptake and cytotoxicity of multi-walled carbon nanotubes, graphene oxide, and nanodiamond[J]. Toxicology Research,2012, 1: 62-68.

[6]Vaijayanthimala V, Cheng P Y, Yeh S H, et al. The long-term stability and biocompatibility of fluorescent nanodiamond as an in vivo contrast agent[J]. Biomaterials, 2012, 33(31): 7794-7802.

[7]Wenga M F, Chiang S Y, Wang N S, et al. Fluorescent nanodiamonds for specifically targeted bioimaging: Application to the interaction of transferrin with transferrin receptor[J]. Diamond and Related Material, 2009, 18(2-3): 587-595.

[8]Li Y Q, Zhou X P. Transferrin-coupled fluorescence nanodiamonds as targeting intracellular transporters: An investigation of the uptake mechanism[J]. Diamond and Related Material, 2010, 19(10): 1163-1167.

[9]Chow E K, Zhang X Q, Chen M, et al. Nanodiamond therapeutic delivery agents mediate enhanced chemoresistant tumor treatment[J]. Science Translational Medicine,2011, 3(73): 73.

[10]Huang H, Pierstorff E, Osawa E, et al. Active nanodiamond hydrogels for chemotherapeutic delivery[J]. Nano Letter, 2007,7(11): 3305-3314.

[11]Li Y Q, Zhou X P, Wang D X. J Nanodiamond mediated delivery of chemotherapeutic drugs[J]. Material Chemistry, 2011, 21: 16406-16412.

[12]Mohan N, Chen C S, Hsieh H H, et al. In vivo imaging and toxicity assessments of fluorescent nanodiamonds in caenorhabditis elegans[J]. Nano Letter, 2010, 10(9): 3692-3699.

[13]Fu C C, Lee H Y, Chen K, et al. Characterization and application of single fluorescent nanodiamonds as cellular biomarkers[J]. PNAS, 2007, 104(3): 727-732.

[14]Wang D X, Tong Y L, Li Y Q, et al. PEGylated nanodiamond for chemotherapeutic drug delivery[J]. Diamond and Related Material, 2013, 36: 26-34.

[15]Chen B, Liu Q L, Zhang Y L, et al. Transmembrane delivery of the cell-penetrating peptide conjugated semiconductor quantum dots[J]. Langmuir, 2008, 24(20): 11866-11871.

[16]Qian Z M, Li H, Sun H,et al. Targeted drug delivery via the transferrin receptor-mediated endocytosis pathway[J]. Pharmacological Reviews,2002, 54(4): 561-587.

[17]Widera A, Norouziyan F, Shen W C. Mechanisms of TfR-mediated transcytosis and sorting in epithelial cells and applications toward drug delivery[J]. Advanced Drug Delivery Reviews,2003, 55(11): 1439-1466.

[18]Abou-Jawde R, Choueiri T, Alemany C, et al. An overview of targeted treatments in cancer[J]. Clinical Therapeutics,2003, 25(8): 2121-2137.

[19]Tekle C, Deurs BV, Sandvig K, et al.Cellular trafficking of quantum dot-ligand bioconjugates and their induction of changes in normal routing of unconjugated ligands[J]. Nano Letter, 2008, 8(7): 1858-1865.

[20]Kam N W S, Jessop T C, Wender P A, et al. Nanotube molecular transporters: internalization of carbon nanotube-rotein conjugates into mammalian Cell[J]. J. Am. Chem. Soc, 2004, 126(22): 6850-6851.

[21]Kohler N, Sun C, Wang J, et al. Methotrexate-modified superparamagnetic nanoarticles and their Intracellular uptake into human cancer cells[J]. Langmuir,2005, 21(19): 8858-8864.

[22]Chithrani D, Chan W C W. Elucidating the mechanism of cellular uptake and removal of protein-coated gold nanoparticles of different sizes and shapes [J]. Nano Letter, 2007, 7(6): 1542-1550.

[23]Babic M, Hor?k D, Trchov? M, et al. Poly(L-ysine)-odified iron oxide nanoparticles for stem cell labeling[J]. Bioconjugate Chemistry, 2008, 19(3): 740-750.

[24]Letoha T, Ga?l S, Somlai C, et al. Membrane translocation of penetratin and its derivatives in different cell lines[J]. J Mol Recognit, 2003, 16(5): 272-279.

[25]Chen B, Liu Qiaoling, Zhang Yuliang, et al. Transmembrane delivery of the cell-enetrating peptide conjugated semiconductor quantum dots [J]. Langmuir, 2008, 24(20): 11866-11871.

[26]Bao G, Bao X R. Shedding light on the dynamics of endocytosis and viral budding[J]. PNAS, 2005, 102(29): 9997-9998.

(編輯：賈麗紅)

PreparationofTransferrin-CoupledFluorescenceNanodiamondandanInvestigationofItsUptakeMechanismbyHeLaCells

TIANZhimeia,CAORuixiab,WANGDongxina,LILina,WANGQingb,WANGZhiqinb,LIYingqia,b

(a.KeyLaboratoryofChemicalBiologyandMolecularEngineeringofMinistryofEducation,InstituteofMolecularScience,ShanxiUniversity;b.CollegeofChemistryandChemicalEngineering,ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China.)

The biological applications of fluorescent nanodiamonds (FND) have aroused wide concerns. In this work, the targeting system FND-L-f was prepared with the fluorescent nanodiamond (FND) as a platform for delivery of drug and a probe, transferrin (Tf) as a targeted ligand and polylysine (PL) as a bridge. The interaction between the FND-L-f nanoparticles and human cervical carcinoma cells (HeLa cells) as an in vitro model was studied to explore the cellular uptake mechanism of nanoparticles, which could provide valuable theoretical basis for the targeted drug delivery and cancer detection. The results display that the cellular uptake was dependent on FND-L- Τf particle concentration, transferrin ligand density, and dosing time. In addition, the FND-PL-Tf nanoparticles prepared from FND-PL nanoparticles either physically by adsorbing Tf or covalently conjugating Tf could be internalized by the cells through clathrin-dependent and transferrin receptor-mediated endocytosis. Our study implicates that FND-PL-Tf nanoparticles have potential targeted drug delivery and tumor-targeting recognition functions.

fluorescent nanodiamond; polylysine; transferrin; uptake mechanism

2013-08-26

國家自然科學基金資助項目(21071091);山西省科技攻關計劃(社會發展)資助項目(20130313021-1);山西省自然科學基金資助項目(2009011012-3);山西省歸國留學基金資助項目(201011)

田志梅(1986-),女,山西朔州人，碩士研究生,研究方向:生物無機化學,(Tel)18734152011

李英奇,女,教授,(E-mail)wkyqli@sxu.edu.cn

1007-9432(2014)02-0226-07

Q599

:A