綠豆立枯絲核菌研究初報

王 彥，曹志敏，張志肖，蘇秋竹，范保杰，劉長友，田 靜

(河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所，河北省作物遺傳育種重點實驗室，石家莊 050035)

綠豆立枯絲核菌研究初報

王 彥，曹志敏，張志肖，蘇秋竹，范保杰，劉長友，田 靜*

(河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所，河北省作物遺傳育種重點實驗室，石家莊 050035)

本研究通過形態(tài)學(xué)、菌絲融合群和致病力測定研究，對從河北省石家莊地區(qū)綠豆種植區(qū)分離的90個立枯絲核菌進(jìn)行鑒定。在90個分離物中有71個屬于AG4，占供試分離物的78.89%，2個屬于AG2-2，占供試分離物的2.22%，另外17個分離物與標(biāo)準(zhǔn)菌株不融合，占供試分離物的18.89%；屬于AG4的71個分離物中，55個與AG4完全融合(占77.46%)，16個與AG4不完全融合(占22.54%)。在溫室條件下采用人工接菌法對40個代表性分離物的致病力進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)不同分離物對同一品種的致病力存在差異，其中分離物R3、R6、R9、R35致病力最強(qiáng)，分離物R23、R31-1致病力最弱。屬于AG-4的分離物R3、R6、R9、R35與其他供試分離物致病力差異極顯著；屬于未知群體的分離物R20、R29和R24之間致病力差異極顯著；屬于AG2-2的分離物R21、R31-1致病力較弱，且差異不顯著。

綠豆； 立枯絲核菌； 菌絲融合群； 致病力

綠豆是豇豆屬中的一個栽培種，具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值[1]，近年來，國內(nèi)外需求量逐年上升，綠豆種植面積也逐年擴(kuò)大[2]。由于綠豆的連年種植，綠豆病害發(fā)生也隨之加重，導(dǎo)致綠豆產(chǎn)量和質(zhì)量嚴(yán)重下降。在綠豆病害中，由絲核菌引起的苗期立枯病是最重要的病害之一。立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKühn)是一種在自然界中廣泛存在的土傳植物病原真菌，世界各地的耕作和非耕作土壤均有分布，且寄主范圍極廣。立枯絲核菌屬于多核絲核菌，主要引起植物的爛種、根腐、苗期猝倒和立枯病，導(dǎo)致作物缺苗斷垅，被認(rèn)為是最具破壞力的土傳植物病原物之一[3]。本文從形態(tài)鑒定、核相測定、菌絲融合群判定和致病力測定等方面對從石家莊地區(qū)分離的綠豆立枯病菌分離物進(jìn)行研究，旨在明確引起該地區(qū)綠豆立枯病的病原菌種內(nèi)分化情況，為綠豆抗病育種及病害防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 立枯絲核菌融合群標(biāo)準(zhǔn)菌株

立枯絲核菌融合群標(biāo)準(zhǔn)菌株AG-4、AG2-1、AG2-2、AG-5、AG1-IC和AG1-2B由河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病害生物防治實驗室惠贈。

1.2 綠豆立枯病病原菌分離

采用組織分離法[4]對所采集的123株綠豆病樣進(jìn)行病原菌分離，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，初步確定為絲核菌的分離物在PDA培養(yǎng)基25 ℃恒溫培養(yǎng)2～4 d后，挑取單枝菌絲尖端于PDA斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以獲得單細(xì)胞培養(yǎng)物的純分離物。

1.3 形態(tài)學(xué)鑒定及核相測定

取0.6cm待測分離物菌餅接于涂有2%瓊脂層的載玻片中央，將接菌的載玻片置于保濕的培養(yǎng)皿中，25 ℃培養(yǎng)24～36h，取出，加蓋玻片，滴上番紅O-KOH染液，鏡檢。

取0.6cm待測菌餅接于水瓊脂培養(yǎng)基平板上，每菌兩皿，在菌塊周圍成45°斜插入4個蓋玻片，25 ℃恒溫培養(yǎng)，待菌絲長至蓋玻片1/2時，取出蓋玻片，滴上番紅O-KOH(0.5%的番紅6mL，3%的KOH 6mL，甘油3mL和蒸餾水85 mL)染液[5]，鏡檢各分離物細(xì)胞核數(shù)目。

1.4 菌絲融合群判別

參照Parmeter等[6]及陳延熙等改進(jìn)的玻片配對法[7]，將待測絲核菌分離物分別與各標(biāo)準(zhǔn)菌株配對培養(yǎng)，待兩菌落前緣交疊約0.5 cm后，取出載玻片，在兩菌落交疊處滴加0.001%苯胺蘭的稀釋乳酚油溶液，加蓋玻片，鏡檢[8-9]，按下列鑒定標(biāo)準(zhǔn)判別分離物與標(biāo)準(zhǔn)菌株的融合類型。完全融合：接觸細(xì)胞間的細(xì)胞壁溶解，原生質(zhì)融合，并有互誘現(xiàn)象。不完全融合或接觸融合：菌絲接觸后，細(xì)胞壁溶解，一細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)流入另一細(xì)胞內(nèi)，且有殺死反應(yīng)。不融合：有或無引誘現(xiàn)象，菌絲接觸后，細(xì)胞壁不溶解，菌絲自由生長，互不干擾。

1.5 致病力測定

(1)接種方法

取1/4皿菌與700g滅菌土(121℃間歇滅菌2 h)充分混勻后，裝入花盆(直徑15 cm，高13cm)中，將長至2片三出復(fù)葉的幼苗(品種：‘冀綠7號’)移入花盆中，以不接菌滅菌土為空白對照。每處理12棵苗，3次重復(fù)，隨機(jī)排列，定期加水調(diào)節(jié)土壤濕度，25 ℃恒溫培養(yǎng)(12 h光照，12 h黑暗)，接菌7 d后，根據(jù)病情分級標(biāo)準(zhǔn)，調(diào)查發(fā)病情況[10]。

(2)調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)

綠豆立枯病病情分級標(biāo)準(zhǔn)參照Lipps[11]0～5級分級標(biāo)準(zhǔn)：0級無病(無癥狀)；1級為莖稈上有褐斑，不足莖周1/2；2級為病斑達(dá)莖周的1/2；3級為病斑達(dá)莖周的1/2～3/4；4級為病斑超過莖周3/4，直至全株死亡。

按Lipps & Herr的方法[11]計算平均病情指數(shù)，即：

利用 DPS軟件對調(diào)查結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，并采用 Duncan 新復(fù)極差檢驗對立枯絲核菌的致病力進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠豆立枯病病原菌分離

從采集的綠豆立枯病苗上分離到90個立枯絲核菌，占分離物的91%。其中30個分離自河北省鹿泉市，占33.33%，60個分離自河北省藁城市，占66.67%，其形態(tài)特征符合Parmeter[12]對立枯絲核菌的描述。

2.2 病原菌分離物形態(tài)學(xué)鑒定及核相測定

顯微鏡觀察結(jié)果表明，待測分離物的主要形態(tài)如下：菌絲近直角分枝、分枝處縊縮、細(xì)胞多核、有明顯隔膜、產(chǎn)生菌核，屬于立枯絲核菌(如圖1)。

圖1 綠豆立枯病病原菌菌絲形態(tài)Fig.1 Mycelia morphology of the pathogen causing mung bean seedling blight

核相測定結(jié)果表明，立枯絲核菌營養(yǎng)菌絲細(xì)胞為多核，細(xì)胞核數(shù)為3～16個，平均數(shù)為5個。

2.3 菌絲融合群鑒定

對經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為立枯絲核菌的90個分離物進(jìn)行菌絲融合群鑒定(表1)，結(jié)果表明， 71個屬于AG4，占供試分離物的78.89%，2個屬于AG2-2，占供試分離物的2.22%，另有17個分離物與標(biāo)準(zhǔn)菌株不融合，占供試分離物的18.89%，暫定為未知群體。屬于AG4的71個分離物中，55個 與AG4完全融合(占77.46%)，16個與AG4不完全融合(占22.54%)(圖2)。

表1供試分離物與標(biāo)準(zhǔn)菌株的菌絲融合群判別結(jié)果1)

Table1ThehyphaefusionresultsoftestedRhizoctoniasolanistrainsandstandardstrains

菌株號No．ofstrain標(biāo)準(zhǔn)菌株StandardstrainsAG?4AG2?1AG2?2AG?5AG1?ICAG1?2B菌株號No．ofstrain標(biāo)準(zhǔn)菌株StandardstrainsAG?4AG2?1AG2?2AG?5AG1?ICAG1?2BR1?1+-----R1?2+-----R2?1+-----R2?2+-----R3?1+-----R4?1+-----R5?1+-----R5?2+-----R6?1+-----R7?1------R7?2------R8?1+-----R8?2+-----R8?3+-----R8?4+-----R9?1+-----R9?2+-----R10?1+-----R10?2+-----R11?1+-----R11?2+-----R11?3+-----R13?1+-----R14?1------R14?2+-----R14?3------R15?1------R15?2------R18?1+-----R22?1±-----R24?1+-----R24?2+-----R24?3+-----R25?1+-----R26?1+-----R27?1------R31?1--+---R31?2------R31?3------R31?4------R38?1------R38?2------R39?1+-----R40?1±-----R41?1+-----R42?1------R44?1±-----R45?1+-----R46?1+-----R47?1+-----R1+-----R3+-----R6+-----R7+-----R9+-----R10+-----R11+-----R12+-----R13+-----R14+-----R15+-----R16+-----R17+-----R18+-----R19+-----R20------R21--+---R22+-----R23+-----R24------R25+-----R26+-----R27+-----R28+-----R29------R30+-----R32------R33+-----R34+-----R35+-----R37+-----R38+-----R39+-----R40+-----R41+-----R45+-----R47+-----R48+-----R49+-----R50+-----

1)“+”為完全融合；“±”為不完全融合；“-”為不融合。 “+”: Complete fusion; “±”: Incomplete fusion of two mycelia; “-”: Non-fusion.

圖2 菌絲融合類型Fig.2 The type of hyphal fusion

2.4 病原菌菌株致病力測定

通過人工接菌方法對40個供試分離物進(jìn)行致病力測定，結(jié)果表明，接菌7 d后，供試植株均表現(xiàn)典型的立枯病癥狀，對照無癥狀，但不同融合群之間和同一融合群不同分離物之間的致病力存在差異，其中分離物R3、R6、R9、R35致病力最強(qiáng)，分離物R23、R31-1致病力最弱。屬于AG-4的35個分離物中，分離物R3、R6、R9、R35與其他供試分離物致病力差異極顯著；屬于未知群體的3個分離物R20、R29和R24之間致病力差異極顯著；屬于AG2-2的2個分離物R21和R31-1致病力較弱，且差異不顯著[13](表2)。另外，研究發(fā)現(xiàn)AG2-2侵染植株后，植株莖稈褐斑不足莖周的1/2，并不致死苗[14]。

表2部分綠豆立枯絲核菌致病力測定

Table2VirulencetestofR.solanistrains

菌株號No．ofstrain平均病情指數(shù)Averagediseaseindex5%顯著水平5%Levelofsignificance1%極顯著水平1%Levelofsignificance菌株號No．ofstrain平均病情指數(shù)Averagediseaseindex5%顯著水平5%Levelofsignificance1%極顯著水平1%LevelofsignificanceR3100．0000aAR6100．0000aAR9100．0000aAR35100．0000aAR4897．9167aABR4997．9167aABR3897．2233aABR1495．8333abABCR2893．7500abcABCDR1990．9733bcdBCDER3290．2800bcdBCDER4788．8900cdeCDEFR4086．8067defDEFR2786．1100defDEFGR4185．4167defDEFGR1683．3333efgEFGR2081．2500fgFGHR2278．4733ghGHR2675．0000hHIR1568．7500iIJR3068．7500iIJR2566．6667iJKR3466．6667iJKR164．5833ijJKL

續(xù)表2Table2(Continued)

菌株號No．ofstrain平均病情指數(shù)Averagediseaseindex5%顯著水平5%Levelofsignificance1%極顯著水平1%Levelofsignificance菌株號No．ofstrain平均病情指數(shù)Averagediseaseindex5%顯著水平5%Levelofsignificance1%極顯著水平1%LevelofsignificanceR3960．4167jkKLMR2959．7200jkKLMR1357．6400klLMR1752．7800lmMNR2448．6133mNR4516．6667nOR1015．2767nOR1215．2767nOR188．7500oOPR115．9667opPQR215．2767opPQR75．2767opPQR374．9967opPQR504．5833opPQR31?14．1700opPQR234．1700opPQCK0．0000pQ

3 討論

3.1 綠豆立枯絲核菌菌絲融合群研究

國內(nèi)學(xué)者已對多種作物上的立枯絲核菌融合群進(jìn)行了研究[15-21]。2005年楊金紅等[22]對新疆地區(qū)6種豆科植物立枯絲核菌融合群類型的研究表明，該地區(qū)侵染豌豆、豇豆和花生的優(yōu)勢融合群是AG-2，蠶豆的是AG-4，鷹嘴豆的是AG-1，大豆的是AG-1和AG-2。2009年楊金紅[23]又對新疆地區(qū)11種豆科植物立枯絲核菌的融合群類型及營養(yǎng)親和群進(jìn)行了研究，結(jié)果共測定出5個融合群，其中4個融合群下各有2個營養(yǎng)親和群，說明新疆豆科作物立枯絲核菌各主要菌絲融合群內(nèi)均有不同程度的分化。

本研究初步明確綠豆立枯絲核菌菌絲融合群組成有AG-4和AG-2-2，其中AG-4出現(xiàn)頻率最高，分布最廣，是石家莊綠豆立枯病菌的優(yōu)勢融合群，由此可見，綠豆立枯絲核菌也存在菌絲融合群的分化。

3.2 綠豆立枯絲核菌致病力分化研究

目前關(guān)于立枯絲核菌致病力等級沒有統(tǒng)一的劃分標(biāo)準(zhǔn)。李寶棟等[24]關(guān)于棉花立枯菌對不同棉花品種的致病力測定研究中，按病情指數(shù)的高低將棉花品種劃分為高感(病情指數(shù)>75)、中感(75≥病情指數(shù)≥55)和輕感(病情指數(shù)<55)3級。參考棉花分類標(biāo)準(zhǔn)，我們試將立枯絲核菌菌株按病情指數(shù)的高低劃分為強(qiáng)致病力(病情指數(shù)>75)、中等致病力(75≥病情指數(shù)≥55)和弱致病力(病情指數(shù)<55)3級，本文中屬于AG4和未知群體的分離物有強(qiáng)、中、弱之分，屬于AG2-2的2個分離物均為弱致病力菌株。由此可見，分離物所屬菌絲融合群與分離物的致病力強(qiáng)弱無相關(guān)性。

利用致病力測定方法對菌株進(jìn)行鑒定較分子方法(AFLP等)直觀，且能直接反映病菌的致病力強(qiáng)弱及品種抗病性差異。通過致病力測定，確定各種植區(qū)的優(yōu)勢菌株，以篩選到適合不同種植區(qū)的抗病品種，進(jìn)行品種的合理布局。

本文僅對采集自石家莊鹿泉市和藁城市的綠豆病苗進(jìn)行了菌株的分離，并對分離到的菌株進(jìn)行了菌絲融合群及致病力研究，為進(jìn)一步明確河北省綠豆種植區(qū)立枯病病原菌的分布及其分化情況，需要從河北省各綠豆種植區(qū)采集病樣，擴(kuò)大試驗樣本量，并進(jìn)行致病力及分子生物學(xué)研究，為綠豆立枯病病原菌預(yù)警監(jiān)測體系提供技術(shù)支持，同時也為綠豆立枯病病原菌防治提供理論依據(jù)，以期減少綠豆立枯病對綠豆生產(chǎn)造成巨大危害。

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PreliminaryidentificationofRhizoctoniasolanicausingmungbeanseedlingblight

Wang Yan，Cao Zhimin，Zhang Zhixiao，Su Qiuzhu，F(xiàn)an Baojie，Liu Changyou，Tian Jing

(InstituteofCerealandOilCrops,HebeiAcademyofAgriculturalandForestrySciences/LaboratoryofCropGeneticandBreedingofHebeiProvince,Shijiazhuang050035,China)

Ninety isolates ofRhizoctoniasolani,collected from the mung bean field in Shijiazhuang region were characterized by morphology,anastomosis group and pathogenicity test.The results showed that all isolates were multinucleate.Seventy-one isolates belonged to the AG4,accounting for 78.89% of the tested isolates,55 isolates were completely fused with AG4 (77.46%),16strains were incompletely fused with AG4 (22.54%).Two isolates belonged to the AG2-2,accounting for 2.22% There were 17 strains that could not fuse with any standard strains,accounting for 18.89%.Virulence test in greenhouse demonstrated that the isolates R3,R6,R9 and R35 were highly virulent,but isolates R23and R31-1were weakly virulent.There were extremely significant difference between the isolates R3,R6,R9,R35 and the others belonging to AG-4,also between the isolates R20,R29 and R24 belonging to unknown group.The isolates R21and R31-1belonging to AG2-2 were weakly virulent and had no significant difference in virulence.

mung bean;Rhizoctoniasolani; anastomosis group; pathogenicity

2013-07-04

：2013-12-03

國家食用豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-09);河北省科技支撐計劃課題(11220108D)

S 435.22

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.02.009

* 通信作者 Tel: 0311-87670655; E-mail: nkytianjing@163.com