煙草青枯病生防細菌的篩選與生防效果研究

王 超, 申成美, 鄭 麗, 薛慶云, 郭堅華

(南京農業大學植物保護學院植物病理學系，江蘇省生物源農藥工程中心，農作物生物災害綜合 治理教育部重點實驗室,南京 210095)

煙草青枯病生防細菌的篩選與生防效果研究

王 超, 申成美, 鄭 麗, 薛慶云, 郭堅華*

(南京農業大學植物保護學院植物病理學系，江蘇省生物源農藥工程中心，農作物生物災害綜合 治理教育部重點實驗室,南京 210095)

從云南文山煙草種植田煙草植株根圍土壤及植株根內生境中分離純化獲得195株細菌，以細菌菌株對青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)YN10的拮抗作用及其產蛋白酶、幾丁質酶、纖維素酶和產嗜鐵素的活性作為評價指標對其生防潛力進行賦值，對總賦值得分較高的84株菌株做了聚類分析，選擇25株拮抗細菌進行了煙草青枯病溫室防效試驗。結果表明，聚類分析ARDRA圖譜中位于不同組的25株拮抗細菌對煙草青枯病都有不同程度的防治效果，菌株K-1-8、R-3-16、R-3-18的溫室防效分別為86.66%、84.94%、87.57%；拮抗細菌的生防效果與總賦值存在正相關，相關系數達0.86。

生防細菌； 煙草青枯病； 酶活性； 賦值評估； 聚類分析

煙草(NicotianatabacumL.)是雙子葉植物綱(Dicotyledoneae) 茄科(Solanaceae) 一年生草本植物，具有極高的經濟價值，是煙草栽培地區農民收入、地方財政和國家稅收的重要來源之一[1]。煙草青枯病是由茄青枯雷爾氏菌(RalstoniasolanacearumE.F.Smith)引起的維管束病害，是一種毀滅性的土傳細菌性病害[2]，嚴重影響煙草的產量與品質。

隨著煙草種植期延長、病菌致病力發生變化，我國主栽品種‘K326’的抗性逐漸退化，加之栽培管理很難控制，目前煙草青枯病的防治主要依靠化學藥劑來控制和減輕危害[3]。化學藥劑對青枯病雖能起到一定的控制作用，但由于抗藥性和農藥殘留等問題，青枯病的生物防治因其對環境、生態和人畜的安全性引起國內外學者越來越多的重視[4]。Wang等研究發現拮抗菌株K1、K2 對煙草青枯病有明顯的抑制作用,且適當濃度的K1、K2 能改變和破壞青枯菌的形態[5]；曾維愛等的研究表明,苗期接種菌根真菌結合生防制劑不僅能夠有效地防治煙草青枯病,還能改善煙株的農藝性狀,改善煙葉品質[6]；劉偉等在煙草根際土壤篩選出一株對煙草青枯菌有較明顯抑制作用的甲基營養型芽胞桿菌LW-6[7]。李紅麗等認為在病害的原位土壤中分離篩選對病原菌具有拮抗效果的微生物并制成微生物有機肥來防治土傳病害，防病的同時可以改善和修復土壤生態環境[8]。

本研究在云南文山煙草種植田煙草植株根圍土壤及植株根內生境中分離純化獲得了195株細菌，并以拮抗作用、胞外酶活性以及分泌嗜鐵素為指標，結合ARDRA聚類分析選取了25株細菌進行了溫室防治試驗，為土傳病害生防細菌的篩選及煙草青枯病的生物防治提供了方法參考和試驗依據。

1 材料與方法

1.1 供試植物及試驗材料

供試煙草品種為三生煙(Nicotianatobacum‘Samsun’)。青枯雷爾氏菌(R.solanacearum)YN10由本實驗室分離保存。培養基為LB培養基、YGPA培養基[9]和R2A培養基[10]。細菌基因組DNA提取試劑盒購自上海賽百盛基因技術有限公司，引物由上海賽百盛基因技術有限公司合成，PCR擴增反應試劑、限制酶等均購自 TaKaRa 公司。

1.2 樣品采集和細菌分離

分離樣品取自收獲季節的云南省文山市西疇鎮石門坎煙草地，田間采用五點取樣法，每點取健康植株3株和病株2株，采集部位為煙草植株的根系及根圍土(輕拍根系去除根表浮土，用刷子刷下緊附于根表的土即為根圍土)，病健株分開取樣。

取3g根圍土壤樣品，于無菌三角瓶中加27 mL無菌的0.85% NaCl溶液和3g滅菌玻璃珠120r/min 振蕩培養30min，靜置5 min后梯度稀釋，分別取10-4、10-5、10-6稀釋液100μL 涂布在R2A培養基上，每個梯度3個重復，30℃培養48 h。

分別取煙草根系樣品若干，用1%次氯酸鈉浸泡5 min，70%乙醇浸泡1～2 min，無菌水清洗3次后，取3g樣品加27 mL無菌0.85% NaCl溶液研磨，梯度稀釋后取100μL 10-1、10-2、10-3稀釋液涂于R2A培養基上，每個梯度3個重復，30℃培養48 h。

選菌落數在30～300個的平板，計數，挑取不同大小、形態的菌落分離、純化，40%甘油保存于-70℃超低溫冰箱中，備用。

1.3 細菌對YN10平板抑制活性檢測

采用平板對峙法檢測分離所得細菌的拮抗活性，病原指示菌為YN10，培養平板使用YGPA培養基，具體操作參考謝永麗等[11]的方法，進行3次獨立重復試驗，每株參試細菌設置3個重復。

1.4 細菌水解酶活性的測定

1.4.1 蛋白酶活性測定

在蛋白酶平板上(A：脫脂奶粉8 g，溶于300mL水中，115 ℃滅菌10min；B：瓊脂8 g，定容至300mL，121℃滅菌20min，A與B分別滅菌后混合)接菌，30℃培養3d后觀察透明圈有無，并記錄大小[10]。

1.4.2 幾丁質酶活性測定

將細菌在以膠體狀幾丁質[12]為唯一碳源的培養基(Chi-Ayers)上培養(磷酸二氫銨1.0g，氯化鉀0.2 g，水合硫酸鎂0.2 g，膠體狀幾丁質1%(W/V)100mL，瓊脂20g，pH=7.0)，接菌后30℃培養3d，觀察透明圈有無，并記錄大小[13]。

1.4.3 纖維素酶活性測定

參照Ghose 的方法[14]，把準備好的菌株接到纖維素酶活性測定平板上(蛋白胨10g，酵母粉10g，羧甲基纖維素鈉10g，氯化鈉5 g，磷酸二氫鉀1g，瓊脂18 g，pH=7.0)，30℃培養3d后，用1g/L的剛果紅染1h后，倒掉染液，再用1mol/L NaCl溶液浸泡1h，觀察透明圈有無，并記錄大小。

1.5 產嗜鐵素活性測定

參照Shin等的方法[15]。A：① 60.5 mg鉻天青S溶于50mL去離子水；② 10mL三價鐵溶液(1mmol/L FeCl3·6H2O，10mmol/L鹽酸為溶劑)；③ 72.9 mg CTAB 溶于40mL去離子水。上述3個溶液混合定容至100mL，pH調至中性，121℃滅菌20min。B：30.24 g Pipes加入 900mL WA培養基，pH=6.8，121℃滅菌20min。A、B液混合倒平板，接菌后30℃培養3d，觀察、記錄結果。

1.6 細菌的賦值評估

根據Faltin等的方法[16]，對拮抗細菌的生防潛力進行賦值評估，評分如下：平板拮抗YN10活性、產蛋白酶、幾丁質酶活性和產嗜鐵素各3分，其中抑菌圈或透明圈半徑0～3mm為1分，3～6mm賦2分，> 6mm的賦3分；產纖維素酶1分，總分為13分。

1.7 細菌聚類分析

利用基因組DNA試劑盒提取細菌的基因組DNA。采用引物U8-27(F)5′-AGAGTTTGA TC(AC)TGGCTCAG-3′和L1494-1514(R) 5′-CTACGG(AG)TACCTTGTTACGAC-3′擴增細菌基因組DNA中的16S rDNA片段[10]。反應體系為25 μL體系，包括10×PCR Buffer 2.5 μL，Mg2+3.75 μL，dNTP 2 μL，引物P1/P2 0.6μL，模板DNA 1μL，rTaq酶0.5 μL和H2O。反應程序為94 ℃ 5 min，94 ℃ 1min，56℃ 1min，72 ℃ 2 min，30個循環，72 ℃ 10min，12 ℃恒定保溫。

取10μL 16S rDNA擴增產物用MspI酶切(37 ℃，3h)后于混合凝膠檢測(1.5%瓊脂糖+1.5% Synergel，1.0× TAE，80V，1.5 h)，用GelCompar?Ⅱversion 4.5進行圖譜的聚類分析。

1.8 溫室防效試驗

1.8.1 供試菌株菌懸液及病原菌菌懸液的制備

取保存于-70℃超低溫冰箱中的供試細菌菌株及病原菌YN10畫線培養于LB及YGPA平板培養基上。在28 ℃下培養24 h后轉接于相應培養液中，28 ℃，200r/min，培養24 h成種子液。以1∶100的比率在相應培養液中擴繁。28 ℃，200r/min，擴繁24 h后所得菌液相應培養液稀釋，其中供試細菌濃度調至 5×108cfu/mL，YN10濃度調至 5×107cfu/mL，備用。

1.8.2 供試菌株對煙草青枯病的溫室防治試驗

煙草種子經塑料穴盤育苗后，將生長一致的三葉期煙草幼苗移栽至容積約為355 cm3的一次性塑料杯子中繼續培養(溫度26～28 ℃，L∥D=14 h∥10h)。待煙草植株生長至6～7葉期時進行處理，生防菌處理組每株苗澆灌20mL供試菌株菌液，對照組澆灌等體積清水。每個處理組24株煙草苗，每個處理3個重復。供試菌株處理7 d后澆灌YN10菌液，每株20mL。病原菌處理后每天觀察其生長狀況和發病情況，26d后統計最終結果。按照Kempe等[17]提出的病級標準統計病情。病害嚴重度和防效的計算公式如下：

病害嚴重度(%)=

生防效果(%)=

1.9 數據分析

在Microsoft Excel中對平板酶活圈、生防效果等數據進行簡單處理和相關性分析，顯著水平(P<0.05)由DPS v 7.05獲得。

2 結果與分析

2.1 煙草不同生境細菌分離結果

從煙草不同生境中共分離到195株細菌，其中健株根圍樣品分離到80株，病株根圍分離到20株，健株根內分離得到53株，病株根內分離得到42株。在不同生境中，細菌種群密度差異明顯，煙草根圍細菌密度明顯高于根內細菌密度，根圍生境及根內生境的細菌密度分別約為5.20×105cfu/g rs(rhizosphere soil，根圍土)，8.90×103cfu/g fw(fresh weight,根鮮重)。

2.2 煙草不同生境細菌對青枯病生防能力評估

對從不同生境分離到的195株細菌進行了離體拮抗試驗，共有28株細菌具有拮抗作用。各種酶活性的測定結果表明，產蛋白酶細菌所占的比例最高，為75%；而產幾丁質酶的細菌所占的比例最低，為6%；產纖維素酶、嗜鐵素的細菌所占的比例分別為19%和66%。

對上述細菌菌株生物防治煙草青枯病的潛力進行了賦值評估，菌株的總得分在1～8分之間。

2.3 聚類分析結果

為了揭示所獲得的煙草生境細菌的種群結構，利用ARDRA圖譜分析方法對總賦值得分3分以上的84個生防潛力菌株進行了聚類分析(圖 1)，在70%的相似系數下，84個潛力菌株可劃分為12個組(G1～G12)。在這12個組中，只有G1中包含了較多的菌株為36株，G6和G8各含有1株菌株，G9有10株菌株，其他組中包含的菌株數目差別不大，分別為4、6、4、3、5、7、2和5株菌株。

2.4 供試菌株對煙草青枯病的溫室防效

根據賦值評估及聚類分析結果，選擇了8個組(G1、G2、G3、G4、G7、G9、G10和G11)中的25株細菌作為生防潛力菌株進行煙草青枯病溫室防效試驗(表1)。接種YN10后第7天對照組煙草植株即開始發病，底部葉片開始萎蔫，而供試菌株處理組均不同程度推遲了植株的感病時間，病原菌接種后第26天進行了病害嚴重度的統計分析，結果表明25株供試細菌對煙草青枯病均具有一定的防治效果(表1)，供試菌株的溫室防效達87.57%(圖1)。

表125株供試細菌生防潛力的評估及對煙草青枯病的溫室防治效果1)

Table1Assessmentsof25testedstrainsfortheirbiocontrolabilitiesandtheirbiocontrolefficiencyontobaccobacterialwiltingreenhouse

供試菌株Testedstrains生防潛力評估Assessmentforbiocontrolability拮抗活性Antagonism蛋白酶Proteases幾丁質酶Chitinases纖維素酶Cellulases嗜鐵素Siderophores賦值Assessmentpoints溫室試驗Greenhouseexperiments病害嚴重度/%Diseaseseverity生防效果/%BiocontrolefficiencyR?3?1833--28(7．73±0．44)h87．57K?1?823-128(8．30±0．06)g86．66R?3?1623--27(9．36±0．32)g84．94R?5?17-3--36(15．29±0．07)f75．41J?3?833--17(16．59±0．33)f73．33R?2?1723-117(18．42±0．09)ef70．37J?4?233--17(19．26±0．15)e69．03K?1?723--16(19．45±0．01)e68．72R?4?1633---6(19．54±0．10)e68．58R?1?73-1-26(20．58±0．25)e66．91J?3?323--16(23．42±0．04)e62．34R?4?202-2-15(26．17±0．26)d57．92K?1?9-221-5(26．41±0．03)d57．54R?2?8211-15(26．42±0．08)d57．52K?1?5-3--25(27．78±0．01)cd55．33R?3?1413---4(27．78±0．09)cd55．33R?1?1723---5(29．34±0．10)cd52．82R?4?11311-6(29．45±0．39)cd52．64R?4?1223-1-6(30．27±0．05)c51．32R?5?2023--16(31．59±2．40)c49．21R?3?1123-1-6(33．38±0．43)c46．33R?2?1113---4(36．50±0．18)bc41．31K?1?612-1-4(37．55±0．22)bc39．61J?3?21---23(41．23±1．42)b33．69R?5?183---14(41．37±1．46)b33．47對照Control------(62．19±1．01)a-

1) 數值為平均值±標準差，不同字母表示處理間在P<0.05的顯著水平差異顯著(LSD test)。 The values are mean ± SD.Different small letters within a column indicate significant difference by the LSD test (P<0.05).

圖1 供試細菌R-3-18對煙草青枯病的溫室防效Fig.1 Effects of the tested strain R-3-18 against tobacco bacterial wilt in greenhouse

2.5 相關性分析

對25株供試細菌的溫室防效和生防潛力總賦值進行了相關系數分析，以確定我們所采用的賦值系統的可行性。結果顯示(圖 2)，溫室防效與總賦值之間存在正相關，相關系數為0.86。

圖2 生防潛力菌株總賦值與溫室防效的相關性Fig.2 Correlation analysis between assessment points of potential biocontrol agents and their biocontrol efficiency in greenhouse

3 討論

在植物根際和土壤中存在著大量的細菌，其中包括很多對病原菌具有抑制作用的拮抗細菌，可以利用特定的方法分離培養獲得[18]。針對青枯病的土傳性、維管束發病特點，我們從煙草根圍和根內生境分離細菌，通過平板拮抗活性、產酶活性及嗜鐵素分泌等一系列離體試驗對所得菌株進行賦值，結合ARDRA聚類分析建立了一個快速、高效的生防菌篩選體系，從云南文山煙草種植田煙草生境分離純化獲得195株細菌中篩選出11株溫室防治青枯病效果在60%以上的生防細菌。因此，對于植物土傳病害來說，根際土壤和根組織是生防細菌的良好來源。

一個恰當的體外評價系統對生防菌的高效篩選來說意義重大，Berg等針對馬鈴薯真菌病害的生物防治建立了篩選內生細菌的評價系統[19]，對于煙草青枯病生防細菌的篩選，本研究以拮抗活性以及蛋白酶、幾丁質酶、纖維素酶和嗜鐵素等抗細菌物質作為體外評估指標，篩選出的供試細菌生防潛力總賦值與溫室防效的相關系數達0.86，驗證了該篩選體系的可靠性，同時表明拮抗作用和抗菌物質是25株生防細菌防治煙草青枯病的主要作用機制。生防細菌的作用機理包括產生抗菌物質、種群競爭和誘導抗病性等許多方面[20]。因此，要構建一個全面準確的生防細菌高效篩選體系，我們還需要綜合更多的作用機制來全面評估供試菌株的生防潛力。

本研究中發現了3株細菌R-3-18、K-3-16和R-5-17在溫室試驗中表現了良好的生防潛力，經16S rDNA序列比對鑒定為微桿菌屬(Microbacteriumspp.)和微小桿菌屬(Exiguobacteriumspp.)細菌，作為首次發現這兩個屬細菌在煙草青枯病生物防治方面的效果，我們已對其生防機理進行了深入探究(另文發表)。

受煙草生長環境影響，青枯病的田間生物防治相對困難，常規生物防治中單一菌劑在復雜的環境中適應性較差，從而導致防治效果偏低[21-23]。本研究篩選得到了11株溫室防效較好的菌株，其田間防效需進一步驗證，兩株細菌及多株細菌復配使用也值得深入探究。

[1] 朱賢朝,王彥亭,王智發.中國煙草病害[M].北京: 中國農業出版社,2002: 152-162.

[2] Seo S,Gomi K,Kaku H,et al.Identification of natural diterpenes that inhibit bacterial wilt disease in tobacco,tomato and Arabidopsis[J].Plant and Cell Physiology,2012,53(8):1432-44.

[3] 周訓軍,王靜,楊玉文,等.煙草青枯病研究進展[J].微生物學通報,2012,39(10): 1479-1486.

[4] 陳程,黎定軍,陳 武.煙草青枯病生物防治研究進展[J].作物研究,2011,25(6): 639-642．

[5] Wang A A,Zhao Z F,Liu Z Z,et al.Effect of K1,K2 anti-bacterial agents on tobaccoRalstoniasolanacearum[J].Engineering,2010,2: 930-934.

[6] 曾維愛,龍世平,李宏光,等.苗期接種不同叢枝菌根真菌對煙草青枯病防治效果的影響[J].南方農業學報,2011,42(6): 612-615.

[7] 劉偉,沈小英,段軍娜,等.抗煙草青枯病菌的芽胞桿菌篩選和鑒定[J].植物保護學報,2013,40(1): 95-96.

[8] 李紅麗,郭夏麗,李清飛.抑制煙草青枯病生物有機肥的研制及其生防效果研究[J].土壤學報,2010,47(4): 798-801.

[9] 方中達.植病研究方法[M].第3版.北京: 中國農業出版社,1998.

[10]Yang J H,Liu H X,Zhu G M,et al.Diversity analysis of antagonists from rice-associated bacteria and their application in biocontrol of rice diseases[J].Journal of Applied Microbiology,2008,104：91-104.

[11]謝永麗,高學文.高寒草甸根圍拮抗芽胞桿菌篩選鑒定及脂肽化合物分析[J].中國生物防治學報,2012,28(3): 367-374.

[12]Roberts W K,Selitrennikoff C P.Plant and bacterial chitinases differ in antifungal activity[J].Journal of General Microbiology,1988，134: 169-176.

[13]鄭穎.利用根圍促生細菌防治香蕉枯萎病的篩選策略研究及大田防效驗證[D].南京: 南京農業大學,2010.

[14]Ghose T K.Measurement of cellulase activities[J].Pure and Applied Chemistry,1987，59: 257-268.

[15]Shin S H,Lim Y,Lee S E,et al.CAS agar diffusion assay for the measurement of siderophores in biological fluids[J].Journal of Microbiological Methods,2001，44: 89-95.

[16]Faltin F,Lottmann J,Grosch R,et al.Strategy to select and assess antagonistic bacteria for biological control ofRhizoctoniasolaniKühn[J].Canadian Journal of Microbiology,2004，50: 811-820.

[17]Kempe J,Sequeira L.Biological control of bacterial wilt of potatoes: Attempts to induce resistance by treating tubes with bacteria[J].Plant Disease,1983,67(5): 499-501.

[18]程亮,游春平,肖愛萍.拮抗細菌的研究進展[J].江西農業大學學報,2003,25(5): 732-737.

[19]Berg G,Krechel A,Ditz M,et al.Endophytic and ectophytic potato associated bacterial communities differ in structure and antagonistic function against plant pathogenic fungi[J].FEMS Microbiology Ecology,2005,51:215-229.

[20]劉郵洲,陳志誼,梁雪杰,等.番茄枯萎病和青枯病拮抗細菌的篩選、評價與鑒定[J].中國生物防治學報,2012,28(1):101-108.

[21]黃世群,丁佶,石萬成.防治青枯病(姜瘟病)的生物農藥——青枯停[J].四川農業科技,2008(3): 53.

[22]柳輝林,張劍,徐隆根,等.熒光假單胞3000億個/g粉劑防治煙草青枯病田間藥效試驗[J].農藥科學與管理,2008,29(6)：24-26.

[23]魏鴻剛,李淑蘭.防治作物青枯病和枯萎病的微生物農藥——0.1億 CFU/g多粘類芽胞桿菌細粒劑[J].世界農藥,2008,30(1): 51-52.

Isolationandscreeningofantagonisticbacterialstrainsandtheirbiocontrolefficiencyagainstbacterialwilt

Wang Chao, Shen Chengmei, Zheng Li, Xue Qingyun, Guo Jianhua

(DepartmentofPlantPathology,CollegeofPlantProtection,NanjingAgriculturalUniversity;EngineeringCenterofBioresourcePesticideinJiangsuProvince;KeyLaboratoryofIntegratedManagementofCropDiseasesandPests,MinistryofEducation,Nanjing210095,China)

In order to screen antagonistic bacteria for controlling tobacco bacterial wilt,195 bacterial strains were isolated and purified from rhizosphere soil and endorhiza of tobacco plants in Wenshan,Yunnan Province.Assessment was made according to their antagonistic activity againstRalstoniasolanacearumYN10and the ability to secrete hydrolytic enzymes and siderophoresinvitro.Eighty-four strains with higher assessment points were selected for cluster analysis.Finally,the antagonistic activity of 25 potential biocontrol agents(BCA)againstR.solanacearumwere investigated to in greenhouse.Three BCA isolated,K-1-8,R-3-16and R-3-18 were demonstrated to have good control efficiency on tobacco bacterial wilt,with the efficiency of 86.66%,84.94% and 87.57%,respectively.The results of the assessment system were positively correlated (r=0.86) with those obtained from the greenhouse experiment.

biocontrol agents; tobacco bacterial wilt; enzyme activity; assessment; cluster analysis

2013-06-26

：2013-08-31

國家自然科學基金項目(31177809)

S 476

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.02.008

* 通信作者 E-mail: jhguo@njau.edu.cn